本发明所涉及制备阿糖腺苷的方法，以阿糖尿苷和腺嘌呤为主原料，通过利用核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶合成阿糖腺苷，属于生物。
背景技术：
1、阿糖腺苷(vidarabine)，化学名为9-β-d-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤，cas登录号：5536-17-4，分子式为c10h13n5o4，分子量267.24，白色至灰白色结晶粉末。阿糖腺苷属于核苷类抗病毒药物，具有广谱的抗病毒活性，对疱疹病毒及带状疱疹病毒作用最强，对水痘带状疱疹病毒、牛痘病毒、乙肝病毒作用次之，对腺病毒、伪狂犬病毒和一些rna肿瘤病毒也有效。阿糖腺苷是医药工业中制造单磷酸阿糖腺苷、腺苷三磷酸、辅酶、氟达拉滨及系列产品环磷酸腺苷等药物的主要原料。
2、现有技术中，阿糖腺苷的合成方法包括化学法合成、发酵法和生物转化法合成法。
3、化学法合成阿糖腺苷的传统化学法是以5'-腺嘌呤核苷酸(5'-amp)为原料，经选择性对甲苯磺酰化、水解脱磷、溴化和乙酰化得8-羟基-n,3',5'-o-二乙酰基-2'-o-对甲苯磺酰基腺苷，在甲醇/氨中环化，再在甲醇/硫化氢开环得8-巯基阿糖腺苷，经氢解脱硫最终得阿糖腺苷。其工艺复杂，反应条件苛刻，原料成本高，使用重金属试剂，污染环境。
4、而生物发酵法生产周期长，收率比较低，导致生产成本大幅上升。20世纪90年代起国内已开始尝试利用生物转化合成阿糖腺苷。华东理工大学冯万祥、周兴明用大肠杆菌b23生物转化合成阿糖腺苷，其得率对应腺嘌呤的转化率34％，对应阿糖尿苷的转化率12％[工业微生物，1994，24(4):11-14]。生物转化方法具有反应条件温和，反应步骤简单，不使用有毒有害试剂，不污染环境的等优点。因此目前采用生物转化合成法合成阿糖腺苷是一种良好的趋势。
5、但鉴于现有生产技术存在的不足，特提出本发明改进后生化转化制备阿糖腺苷的方法。
技术实现思路
1、鉴于以上生产技术缺陷，本发明工艺在于以廉价原料磷酸二氢钾为磷酸供体、阿糖尿苷和腺嘌呤为底物，利用核苷磷酸化酶(purine nucleosidephosphorylase，pnp)和尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase，udp)共同作用进行生物转化，得到阿糖腺苷，整个过程相当于利用核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶一步生成阿糖腺苷，开发了一条合成阿糖腺苷的新途径。该工艺过程简单、原料来源方便，成本低廉、生产周期短、产物收率高、可操作性强，具备极强市场竞争力。
2、本发明所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，包括如下步骤：以阿糖尿苷和腺嘌呤为原料，在核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶共同作用下进行生物转化，得到阿糖腺苷。
3、采用反应方程式表示为：
4、
5、进一步地，在上述技术方案中，所述反应体系中加入mg2+启动反应。
6、进一步地，在上述技术方案中，所述核苷磷酸化酶的序列如seq id no.1所示核苷酸序列。
7、seq id no.1
8、atggctaccccacacattaatgcagaaatgggcgatttcgctgacgtagttttgatgccaggcgacccgctgcgtgcgaagtatattgctgaa
9、actttccttgaagatgcccgtgaagtgaacaacgttcgcggtatgctgggcttcaccggtacttacaaaggccgcaaaatttccgtaatgggtca
10、cggtatgggtatcccgtcctgctccatctacaccaaagaactgatcaccgatttcggcgtgaagaaaattatccgcgtgggttcctgtggcgca
11、gttctgccgcacgtaaaactgcgcgacgtcgttatcggtatgggtgcctgcaccgattccaaagttaaccgcatccgttttaaagaccatgacttt
12、gccgctatcgctgacttcgacatggtgcgtaacgcagtagatgcagctaaagcactgggtattgatgctcgcgtgggtaacctgttctccgctg
13、acctgttctactctccggacggcgaaatgttcgacgtgatggaaaaatacggcattctcggcgtggaaatggaagcggctggtatctacggcg
14、tcgctgcagaatttggcgcgaaagccctgaccatctgcaccgtatctgaccacatccgcactcacgagcagaccactgccgctgagcgtcag
15、actaccttcaacgacatgatcaaaatcgcactggaatccgttctgctgggcgataaagagtaa
16、进一步地，在上述技术方案中，所述尿苷磷酸化酶的序列如seq id no.2所示核苷酸序列。
17、seq id no.2
18、atgtccaagtctgatgtttttcatctcggcctcactaaaaacgatttacaaggggctacgcttgccatcgtccctggcgacccggatcgtgtgga
19、aaagatcgccgcgctgatggataagccggttaagctggcatctcaccgcgaattcactacctggcgtgcagagctggatggtaaacctgttat
20、cgtctgctctaccggtatcggcggcccgtctacctctattgctgttgaagagctggcacagctgggcattcgcaccttcctgcgtatcggtacaa
21、cgggcgctattcagccgcatattaatgtgggtgatgtcctggttaccacggcgtctgtccgtctggatggcgcgagcctgcacttcgcaccgct
22、ggaattcccggctgtcgctgatttcgaatgtacgactgcgctggttgaagctgcgaaatccattggcgcgacaactcacgttggcgtgacagct
23、tcttctgataccttctacccaggtcaggaacgttacgatacttactctggtcgcgtagttcgtcactttaaaggttctatggaagagtggcaggcg
24、atgggcgtaatgaactatgaaatggaatctgcaaccctgctgaccatgtgtgcaagtcagggcctgcgtgccggtatggtagcgggtgttatc
25、gttaaccgcacccagcaagagatcccgaatgctgagacgatgaaacaaaccgaaagccatgcggtgaaaatcgtggtggaagcggcgcgt
26、cgtctgctgtaa
27、进一步地，在上述技术方案中，本发明实际以阿糖尿苷、腺嘌呤为原料，在转化体系中加入少量mg2+启动反应，在一种菌体中表达两种酶，包括核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶共同作用下进行生物转化，得到阿糖腺苷。
28、本发明以阿糖尿苷、腺嘌呤为底物，偶联合成阿糖腺苷的方法，整个合成过程具体包括：酶的制备(核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶制备)、转化反应、产物提取等三个过程。
29、进一步地，在上述技术方案中，偶联转化反应体系为：阿糖尿苷180-220g/l，腺嘌呤105-120g/l，氯化镁5-6g/l，湿菌体酶45-60g/l。
30、进一步地，在上述技术方案中，酶的制备为：菌种活化后制备种子液，以2-10％接种量接种至发酵罐，进行连续流高密度发酵培养。
31、进一步地，在上述技术方案中，核苷磷酸化酶及尿苷磷酸化酶制备包括：将pnp、udp基因工程菌在合适条件下进行活化培养。所述pnp、udp基因序列如下所示：
32、seq id no.1所示嘌呤核苷磷酸化酶序列(具体摘于ncbi)；
33、seq id no.2所示尿苷磷酸化酶(具体摘于ncbi)；
34、此基因工程菌进行补料分批高密度发酵培养，待菌体浓度od600＝12-16时加入诱导剂iptg诱导培养8-12h。离心收集该酶的基因工程菌湿菌体。
35、进一步地，在上述技术方案中，偶联转化反应条件为ph＝7.0-8.0，反应温度60-65℃，反应时间96h。在反应体系中添加包括阿糖尿苷及腺嘌呤在内的底物原料，湿菌体酶，并加入少量mg2+催化反应。
36、进一步地，在上述技术方案中，采用流加法进行补充底物，初始添加阿糖尿苷100g/l，腺嘌呤56g/l；每20-24h补加阿糖尿苷50g/l，腺嘌呤28g/l，共补加2次。
37、进一步地，在上述技术方案中，所述产物提取包括合成液预处理、浓缩和精制。即上述转化后，将该产品的合成反应液旋蒸浓缩，降温结晶抽滤得到阿糖腺苷粗品，并将其精制干燥。
38、进一步地，在上述技术方案中，所述核苷磷酸化酶及尿苷磷酸化酶包括但不局限于酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化酶细胞。例如未经纯化的粗酶形式、经部分纯化或完全纯化的形式。
39、发明有益效果
40、1、生物转化反应底物
41、该生物转化合成阿糖腺苷的底物为阿糖尿苷和腺嘌呤，磷酸供体底物原料是以磷酸二氢钾，底物原来廉价，反应简单，极大的缩短了反应周期，降低了反应副产物生成。
42、2、生物转化酶体系
43、该生物转化合成阿糖腺苷利用一个菌体的双酶体系，反应步骤大大缩短，体系转化效率高，底物反应比率高，产物生成量具有较高提升。
44、3、转化反应体系
45、该工艺合成目标产物阿糖腺苷所用反应体系是以纯化水作为反应体系直接进行生物转化反应，成本低廉、对环境友好、易操作、易产业化。
46、4、生产效率高
47、利用该合成技术生产阿糖腺苷，不需要缓冲体系直接进行生物转化反应合成产物尿苷酸，与文献报道相比该工艺目的产物积累浓度高，合成液中阿糖腺苷达到78.3g/l，工艺过程简单、原料来源方便，反应周期短、产物收率高、易于环保。
48、说明书附图
49、图1为实施例2中不同反应温度下阿糖腺苷生成量关系图；
50、图2为实施例3中不同ph下阿糖腺苷生成量关系图；
51、图3为实施例4中两种底物不同配比下阿糖腺苷生成量关系图；
52、图4为实施例5中3l放大转化反应过程hplc检测谱图。
1.生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：以阿糖尿苷和腺嘌呤为原料，在核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶共同作用下进行生物转化，得到阿糖腺苷。
2.根据权利要求1所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：所述核苷磷酸化酶的序列如seq id no.1所示核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：所述尿苷磷酸化酶的序列如seq id no.2所示核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：反应体系中加入mg2+启动反应。
5.根据权利要求1所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：整个合成过程包括：酶的制备、偶联转化反应、产物提取。
6.根据权利要求5所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：偶联转化反应体系为：阿糖尿苷180-220g/l，腺嘌呤105-120g/l，氯化镁5-6g/l，湿菌体酶45-60g/l。
7.根据权利要求5所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：酶的制备为，菌种活化后制备种子液，以2-10％接种量接种至发酵罐，进行连续流高密度发酵培养。
8.根据权利要求5物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：偶联转化反应条件为ph＝7.0-8.0，反应温度60-65℃，反应时间96h。
9.根据权利要求5所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：采用流加法进行补充底物，初始添加阿糖尿苷100g/l，腺嘌呤56g/l；每20-24h补加阿糖尿苷50g/l，腺嘌呤28g/l，共补加2次。
10.根据权利要求5所述生物转化合成阿糖腺苷的方法，其特征在于：所述产物提取包括合成液预处理、浓缩和精制。
