本发明涉及基因工程，尤其涉及一种陆地棉基因组编辑表达载体及其构建方法与应用。
背景技术：
1、众所周知，鉴定基因功能和选育作物新品种都离不开突变体的获得，在基因编辑技术问世前，我们获得突变体主要依靠物理诱变、化学诱变及自然突变等方法，但这些方法与基因编辑技术相比都存在一定的局限性，基因编辑技术的出现为突变体的获得提供了一种全新的方法。
2、基因编辑技术可以通过靶向特定的dna对基因组序列进行修改，对特定的基因进行突变，目前能够广泛应用在农作物生物育种中。到目前为止，多种类型的基因编辑系统在作物中得到了应用，包括锌指核酸酶基因编辑系统(zinc-fingernucleases，zfns)，类转录激活因子核酸酶基因编辑系统(ranscriptionactivator-like effectornucleases，talens)和第三代规律成簇的间隔短回文重复序基因编辑系统(crisprsystem)，这些基因编辑技术可以将基因组中的特定序列破坏后，主要通过非同源末端连接(nonhomologousend-joining，nhej)或同源重组修复(homologydirectedrepair，hdr)这两种修复途径达到基因敲除或基因编辑的目的对双链断裂位置进行修复，在修复过程中，断裂位点会出现碱基缺失，碱基突变或者碱基插入现象，从而导致基因组序列产生变化，形成基因敲除。
3、crispr/cas9编辑系统对特异dna双链进切割个形成dsbs(double strandbreaks)后细胞内修复方式以nhej修复为主，多数情况下会在dna切割位点附近引入小片段核酸的插入或缺失，引起蛋白翻译过程中密码子的移码突变破坏相应基因的功能。在植物中crispr/cas9虽被广泛应用，但与crispr/cas12a(cpf1)相比有很多不足。crispr/cas12a也只需一个cas蛋白就能切割双链dna，但编辑的过程与crispr/cas9完全不同，与crispr/cas9编辑系统相比，crispr/cas12a编辑系统具有切割位点远离pam序列和连续切割dna的优点，能潜在地产生更高的编辑效率和更大的片段缺失。同时，cas12a蛋白识别富含胸腺嘧啶的5’-tttv-3’的pam序列，扩大了靶标位点的选择范围；cas12a蛋白可以靶向dsdna，也可以靶向ssdna，具有顺式和反式双重切割活性；cas12a还具有较高的特异性，与cas9相比脱靶率要更低。
4、启动子作为启动基因转录的一段dna序列，对基因的表达调控至关重要，其通过rna聚合酶进行识别与结合，进而来控制基因表达的起始和表达强度。根据启动子识别rna聚合酶的能力，可将启动子分为pol ii和pol iii类型。通常，在基因基因编辑载体系统中，grna的表达由rna聚合酶iii驱动的启动子(u6/u3)驱动，而基于rna聚合酶ii的泛素和camv35s启动子被用于cas9基因表达。并且，相比于异源启动子，同源或近源的启动子有利于提高目的基因表达强度，使转基因表达更具稳定性和可重复性，来源于外源病毒的camv 35s启动子可能具有生物安全的不确定性。同时，有研究表明在人类和植物细胞中基于pol iii启动子的系统不适合表达多个crrnas，效率较低。
5、棉花(gossypium spp)是重要的经济作物，棉花纤维在已知的天然纤维中纯度最高，在全球纺织业中都具有重要价值，为人类提供了巨大的利益，是全球重要的原材料。在棉花中建立多种不同的crispr基因编辑系统，有利于对棉花功能基因的验证，能够加快常规育种与分子育种相结合的进程，培育兼具产量，品质及抗性优良的品种。但目前很少看到有报道针对棉花crispr/cas12a基因编辑系统的优化方案。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种陆地棉基因组编辑表达载体及其构建方法与应用，通过采用棉花内源pghαgloa启动子驱动ghpgf基因的crrnas构建了pghrbe3-pghαgloa-ghpgf表达载体，以此优化棉花crispr/cas12a基因编辑系统。
2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
3、本发明的第一方面在于提供了一种陆地棉基因组编辑表达载体，所述表达载体为pghrbe3-pghαgloa-ghpgf，所述表达载体pghrbe3-pghαgloa-ghpgf中pghαgloa的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本发明的第二方面在于提供了一种陆地棉基因组编辑表达载体的构建方法，所述构建方法如下：
5、筛选棉花启动子pghαgloa，将启动子pghαgloa插入酶切后的pghrbe3-cpf1质粒，测序正确后，得到pghrbe3-pghαgloa双元载体；
6、设计ghpgf 5’端的两个crnas，合成目的片段trna-grna-crrna，将目的片段trna-grna-crrna克隆到双元载体pghrbe3-pghαgloa中，测序正确后，得到pghrbe3-pghαgloa-ghpgf表达载体。
7、结合第二方面，在一些实施方式中，所述构建方法还包括：通过电转法将表达载体导入农杆菌菌株gv3101中，涂于含卡那霉素和利福平抗性的培养皿中，挑取单克隆检测完毕后将阳性菌液保菌，-80℃保存备用。
8、结合第二方面，在一些实施方式中，所述ghpgf 5’端的两个crnas分别为ghpgf-crrna1和ghpgf-crrna2，所述ghpgf-crrna1的靶点序列如seq id no.2所示，所述ghpgf-crrna2的靶点序列如seq id no.3所示。
9、本发明的第三方面在于提供了根据上述所述的陆地棉基因组编辑表达载体或者根据上述所述的构建方法构建的陆地棉基因组编辑表达载体在制备转基因植物中的应用。
10、结合第三方面，在一些实施方式中，所述转基因植物为棉花或拟南芥。
11、本发明具有以下有益效果：
12、1.本申请构建的表达载体能够在棉花中高效驱动crispr/cas12a基因编辑系统的crrnas，以增强基因编辑的效果，且对所有阳性植株中都存在编辑，其中crrna1靶标在单株中的编辑效率为0.96％-93.37％，crrna2靶标在单株中的编辑效率为0-88.24％；两个位点同时被编辑的效率可以达到66.7％；
13、2.本申请构建的表达载体通过对crispr/cas12a基因编辑系统的优化，还能够获得dna-free的无腺体棉花材料，为棉花生产创制了新的种质资源。
1.一种陆地棉基因组编辑表达载体，其特征在于，所述表达载体为pghrbe3-pghαgloa-ghpgf，所述表达载体pghrbe3-pghαgloa-ghpgf中pghαgloa的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种陆地棉基因组编辑表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：通过电转法将表达载体导入农杆菌菌株gv3101中，涂于含卡那霉素和利福平抗性的培养皿中，挑取单克隆检测完毕后将阳性菌液保菌，-80℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述ghpgf 5’端的两个crnas分别为ghpgf-crrna1和ghpgf-crrna2，所述ghpgf-crrna1的靶点序列如seq id no.2所示，所述ghpgf-crrna2的靶点序列如seq id no.3所示。
5.根据权利要求1所述的陆地棉基因组编辑表达载体或者根据权利要求2-4任一项所述的构建方法构建的陆地棉基因组编辑表达载体在制备转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花或拟南芥。
