本发明涉及非洲猪瘟病毒检测，具体涉及到鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物及检测方法。
背景技术：
1、非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，具有呼吸系统障碍、神经系统症状和全身出血等特征。它的临床表现为发热、呼吸困难、咳嗽、拉稀、神志不清等，病程短促而病死率极高。asfv可通过直接接触、气溶胶、食入受污染的饲料和水源等方式在猪群中快速传播，一旦发生疫情，病猪数量会在短时间内急剧增加。
2、目前，asf对全球养猪业造成了巨大损失，许多国家和地区的养猪业都曾遭遇过asf疫情，导致大量猪只死亡。
3、现有的病毒核酸检测方法主要有以下几种：荧光定量pcr法、测序法、胶体金和化学发光法。其中荧光定量pcr法检测asfv具有灵敏度高，速度快，通量大，通用性强和配套成熟，窗口期相对较短，直接针对目标病毒且可以通过相对丰度来判断病毒感染的程度和用药后的效果等优势。然而，荧光定量pcr法检测病毒核酸，其样本主要为鼻咽拭子、肛拭子、粪便、环境样本拭子等，样本需要进行核酸提取，从样本提取到确认检测结果一般需要4-5h，效率低，且无法评估假阴性和假阳性样本。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物及检测方法，该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，有效解决了现有技术在对毒株检测不能满足当前非洲猪瘟疫情防控需求的问题。
2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，包括b646l基因特异性引物和b646l基因特异性探针、f778r基因特异性引物和f778r基因特异性探针以及cp2475l基因特异性引物和cp2475l基因特异性探针。
3、进一步，上述非洲猪瘟病毒包括非洲猪瘟病毒i型弱毒株、ii型强毒株和i-ii重组毒株。
4、进一步，b646l基因特异性引物包括正向引物和反向引物，其正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、进一步，f778r基因特异性引物包括正向引物和反向引物，其正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6、进一步，cp2475l基因特异性引物包括正向引物和反向引物，其正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
7、进一步，b646l基因特异性探针包括如seq id no.7所示的核苷酸序列。
8、进一步，f778r基因特异性探针包括如seq id no.8所示的核苷酸序列。
9、进一步，cp2475l基因特异性探针包括如seq id no.9所示的核苷酸序列。
10、进一步，b646l基因特异性探针的5′端修饰的报告基团为fam，3′端修饰的淬灭基团为bhq1。
11、进一步，f778r基因特异性探针的5′端修饰的报告基团为vic，3′端修饰的淬灭基团为bhq1。
12、进一步，cp2475l基因特异性探针的5′端修饰的报告基团为cy5，3′端修饰的淬灭基团为bhq1。
13、进一步，b646l基因特异性引物和b646l基因特异性探针用于检测非洲猪瘟病毒。
14、进一步，f778r基因特异性引物和f778r基因特异性探针用于检测非洲猪瘟病毒i型弱毒株。
15、进一步，cp2475l基因特异性引物和cp2475l基因特异性探针用于检测非洲猪瘟病毒ii型强毒株。
16、本发明还提供了利用上述鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物的检测方法，包括以下步骤：
17、s1、对样品进行预处理，提取核酸，得待测核酸；
18、s2、以步骤s1所得待测核酸为模板，利用鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，进行多重荧光定量pcr反应；
19、s3、根据三个通道的荧光信号结果判定非洲猪瘟病毒毒株类型。
20、进一步，步骤s2中，多重荧光定量pcr反应体系的总体积为25μl，包括5μl模板、12.5μl 2×animal detection u+probe master mix、0.5μl p72-f、0.5μl p72-f、0.5μlf778r-f、0.5μl f778r-r、0.5μlcp2475l-f、0.5μl cp2475l-r、0.5μl p72-p、0.5μl f778r-p、0.5μlcp2475l-p和3μl去离子水。
21、进一步，引物与探针的浓度为5-15umol/l。
22、进一步，引物与探针的浓度为10umol/l。
23、进一步，多重荧光定量pcr反应的程序为95-96℃预变性2-3min，95-96℃变性5-6s，61-62℃退火35-36s，39-40个循环。
24、进一步，多重荧光定量pcr反应的程序为95℃预变性2min，95℃变性5s，61℃退火35s，40个循环。
25、进一步，步骤s3中，判定的具体方法为：当b646l和f778r基因检测出扩增曲线时，所述样品中含有非洲猪瘟病毒i型弱毒株；当b646l和cp2475l基因检测出扩增曲线时，所述样品中含有非洲猪瘟病毒ii型强毒株；当b646l、f778r和cp2475l基因检测出扩增曲线时，所述样品中含有非洲猪瘟病毒i-ii重组毒株。
26、综上所述，本发明具有以下有益效果：
27、1、本发明可以在一个反应里能同时检测非洲猪瘟病毒b646l、f778r和cp2475l基因，不仅能够获知是否存在非洲猪瘟的感染，而且能够鉴别i型弱毒株、ii型强毒株和i-ii重组毒株，省时高效。
28、2、本发明针对三个靶标的扩增相互不干扰，且特异性强、灵敏度高、重复性好，且三个靶标的扩增均可以低至单个拷贝，充分保证了对每个靶标的扩增，保证了每个靶标的高灵敏度。
29、3、本发明综合各种因素分别设计了针对这三个靶标的多套引物探针组合，并且根据反应的特异性、扩增的效率进行筛选与优化，最终选择出本发明的引物和探针组合，达到极其优异的效果。
1.鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物包括b646l基因特异性引物和b646l基因特异性探针、f778r基因特异性引物和f778r基因特异性探针以及cp2475l基因特异性引物和cp2475l基因特异性探针。
2.如权利要求1所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒包括非洲猪瘟病毒i型弱毒株、ii型强毒株和i-ii重组毒株。
3.如权利要求1所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述b646l基因特异性引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seq idno.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.如权利要求1所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述f778r基因特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq idno.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
5.如权利要求1所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述cp2475l基因特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq idno.5所示；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
6.如权利要求1所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述b646l基因特异性探针包括如seq id no.7所示的核苷酸序列；所述f778r基因特异性探针包括如seq id no.8所示的核苷酸序列；所述cp2475l基因特异性探针包括如seq idno.9所示的核苷酸序列。
7.如权利要求1或6所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物，其特征在于，所述b646l基因特异性探针的5′端修饰的报告基团为fam，3′端修饰的淬灭基团为bhq1；所述f778r基因特异性探针的5′端修饰的报告基团为vic，3′端修饰的淬灭基团为bhq1；所述cp2475l基因特异性探针的5′端修饰的报告基团为cy5，3′端修饰的淬灭基团为bhq1。
8.利用权利要求1所述的鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的利用鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物的检测方法，其特征在于，步骤s2中，所述多重荧光定量pcr反应的程序为95-96℃预变性2-3min，95-96℃变性5-6s，61-62℃退火35-36s，39-40个循环。
10.如权利要求8所述的利用鉴别非洲猪瘟病毒的pcr引物和探针组合物的检测方法，其特征在于，步骤s3中，所述判定的具体方法为：当b646l和f778r基因检测出扩增曲线时，所述样品中含有非洲猪瘟病毒i型弱毒株；当b646l和cp2475l基因检测出扩增曲线时，所述样品中含有非洲猪瘟病毒ii型强毒株；当b646l、f778r和cp2475l基因检测出扩增曲线时，所述样品中含有非洲猪瘟病毒i-ii重组毒株。
