本发明属于生物医药，具体涉及circrna在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
背景技术：
1、因创伤、退变引起的关节骨、软骨损伤是影响人民健康、制约全民健身的主要因素之一，如何有效修复关节骨、软骨缺损一直是外科治疗领域迫切需要解决的医学难题。其中，骨性关节炎(osteoarthritis，oa)以关节软骨变性和继发性成骨为特征，最早的病理改变见于关节软骨，如较大的负重关节，包括膝关节、髋关节和脊柱小关节等，其中尤以膝关节骨性关节炎最为普遍。膝关节oa是成人致残的主要原因，也是患病率高、严重影响人们生活质量的主要慢性疾病之一。目前我国有超过1.4亿oa患者，但其病理尚不完全清楚。研究表明，oa与年龄、肥胖、关节外伤、机械损伤、性别等因素有关，其病理可能与软骨的退行性病变有关，这些病变继发于与增生和软骨细胞凋亡相关的炎症。目前，临床上对oa的检测与诊断方法包括x线检测、核磁共振(mri)检测、koos评分、lysholm评分、womac评分等。临床上对oa治疗常采用的药物包括非甾体类抗炎药物(nsaids，如布洛芬、双氯芬酸、洛索洛芬、塞来昔布、尼美舒利、双氯芬酸二乙胺乳胶剂、洛索洛芬钠贴剂、布洛芬凝胶等)、关节腔注射药物(糖皮质激素、玻璃酸钠等)、缓解oa症状的慢作用药物(sysadoas，如双醋瑞因、氨基葡萄糖等)和辣椒碱、中药膏剂、外用麻醉剂等。但是，使用上述这些药物时，需要根据患者的症状、年龄、合并症等因素进行综合考虑，制定个性化的治疗方案。对于严重的oa患者，可能还需要结合物理治疗、手术治疗等综合治疗手段，且上述治疗手段存在只能缓解症状、不能逆转oa进程、治标不治本，需要多次手术、患者经济负担较重等弊端。而基因水平的检测以及新型基因药物的研发能够为oa的临床诊断以及治疗提供新策略。
2、环形rna(circular rna，circrna)是1976年首次发现的、由线性rna的3'端和5'端经反向剪接、共价结合形成的环形ncrna分子，具有结构稳定、序列保守及组织表达特异性等特征，广泛存在于真核生物的各种组织器官中。circrna的作用包括作为微小rna(microrna，mirna)的分子海绵、调控基因表达、与蛋白质互作、翻译蛋白质和疾病生物标志物等。研究表明，circrna与癌症、oa、心血管病等多种疾病的发生发展相关。并且，由于circrna具有耐rna外切酶酶解、半衰期长、结构稳定等特性，因此其在oa等疾病的诊断以及治疗中的作用一直是国内外研究的热点。
3、腺相关病毒(aav)作为一种基因表达载体，已被广泛用于体内研究水平的基因表达、基因操作和基因治疗，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长、可用于无创治疗等特点。现阶段，已报道的circrna种类众多，而不同种类的circrna在oa中的作用机制以及作用效果有待进一步拓展。目前现有技术并未公开能够用于骨关节炎治疗的具体circrna的序列结构，并且本发明所涉及的circrna在骨关节炎中的调节作用及机制尚未见报道，因此有望为oa诊断和基因治疗提供新靶点和新方向。
技术实现思路
1、针对现有技术中的不足，本发明的第一目的在于提供circrna在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，通过circrna过表达，能够显著改善oa软骨缺损，因此circrna可以作为骨关节炎的潜在治疗靶点。
2、本发明的第二目的还在于提供一种用于治疗骨关节炎的病毒包装质粒。
3、本发明的第三目的还在于提供一种病毒包装质粒的应用，具体是在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
4、本发明的第四目的还在于提供一种治疗骨关节炎的药物。
5、本发明的第五目的还在于提供一种定量检测circrna的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，试验发现circrna在人骨关节炎中显著低表达，因此通过定量检测circrna，能够应用于oa的临床诊断以及预后判断。
6、为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案是：
7、circrna在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8、一种用于治疗骨关节炎的病毒包装质粒，所述病毒包装质粒为腺相关病毒aav包装的含circrna的质粒；所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq idno.1所示。
9、作为一个优选的方案，所述病毒包装质粒的构建方法是：将circrna的序列插入aav腺相关病毒表达质粒的多克隆位点以构建得到。
10、作为一个优选的方案，所述aav腺相关病毒表达质粒为phbaav-cmv-mcs-ef1-zsgreen。腺相关病毒aav具有表达滴度高、安全性高、宿主免疫反应轻微等优势，近年来成为基因治疗领域应用广泛的病毒载体之一。
11、本发明将circrna的序列插入到上述腺相关病毒表达质粒后，构建的病毒包装质粒，依次包含aav2 itr(腺相关病毒2型(aav2)反转录后重复序列)、cmv启动子、circrna序列、ef1启动子、zsgreen1、wpre、hgh poly(a)signal、aav2 itr、f1 ori、ampr启动子、ori，其能够有效实现circlrba的过表达。
12、一种病毒包装质粒的应用，在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
13、一种治疗骨关节炎的药物，所述药物为腺相关病毒aav包装的含circrna的质粒；所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
14、一种定量检测circrna的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
15、作为一个优选的方案，所述试剂通过实时荧光定量pcr实现circrna的检测；所述试剂包括能够特异性结合circrna的上游引物和下游引物。
16、作为一个优选的方案，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
17、作为一个优选的方案，所述试剂还包括内参上游引物和内参下游引物；所述内参上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述内参下游引物的核苷酸序列如seq idno.5所示。
18、本发明上述技术方案的有益效果是：
19、本发明采用生物信息学方法从生物高通量检测数据库中筛选，初步筛选出与骨关节炎(oa)相关的circlrba，然后结合差异表达基因分析结果，根据结果中的差异倍数值，筛选出差异倍数在2倍以上的circrna。通过筛选其中长度小于500bp、对oa调节作用与机制未知的序列作为目的circrna，得到如seq id no.1所示的circrna，其全长450bp，又称为circlrba。本发明对筛选得到的circlrba，经特异双向引物检测、rnase r酶降解和sanger测序试验，验证了其环形特征和耐rna外切酶酶解特性，表明本发明筛选的circrna正确。
20、进一步地，本发明通过试验研究发现，circlrba在人骨关节炎疾病组织和小鼠软骨细胞炎症模型中均显著低表达，因此可将circlrba作为oa临床诊断的依据，通过设计circlrba的特异性引物，可应用于oa的临床诊断以及预后判断，对进一步阐明oa发生发展机理具有重要意义。
21、更进一步地，本发明利用筛选到的与oa相关circlrba分子，构建腺相关病毒aav过表达载体，然后体内验证circlrba对oa的治疗作用。试验发现，circlrba能显著改善小鼠oa软骨缺损。因此，circlrba可作为oa临床治疗的新型靶点和潜在药物，有望在oa治疗中发挥重要作用，也为骨关节炎的治疗药物研发提供了新方向。
22、因此，本发明的本项研究，证实了circlrba在oa的临床诊断、预后判断或靶向治疗中的应用价值，不仅有利于进一步阐明oa发生发展机理，也有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，同时也有望促进circrna在oa治疗中的应用。
1.circrna在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种用于治疗骨关节炎的病毒包装质粒，其特征在于，所述病毒包装质粒为腺相关病毒aav包装的含circrna的质粒；所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求2所述的用于治疗骨关节炎的病毒包装质粒，其特征在于，所述病毒包装质粒的构建方法是：将circrna的序列插入aav腺相关病毒表达质粒的多克隆位点以构建得到。
4.根据权利要求3所述的用于治疗骨关节炎的病毒包装质粒，其特征在于，所述aav腺相关病毒表达质粒为phbaav-cmv-mcs-ef1-zsgreen。
5.如权利要求2～4任一项所述的病毒包装质粒的应用，其特征在于，在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
6.一种治疗骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物为腺相关病毒aav包装的含circrna的质粒；所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.一种定量检测circrna的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述circrna为circlrba；所述circlrba的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.根据权利要求7所述的定量检测circrna的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述试剂通过实时荧光定量pcr实现circrna的检测；所述试剂包括能够特异性结合circrna的上游引物和下游引物。
9.根据权利要求8所述的定量检测circrna的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.根据权利要求8或9所述的定量检测circrna的试剂在制备用于骨关节炎的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述试剂还包括内参上游引物和内参下游引物；所述内参上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述内参下游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
