本发明属于生物。具体地说，本发明涉及一种糖基转移酶突变体、其构建方法以及在瑞鲍迪苷d(reb d)合成中的应用。
背景技术：
1、甜菊糖是一种重要的天然甜味剂，主要由甜菊糖苷组成，已在巴拉圭和日本广泛使用。甜菊糖苷热量低，甜度高，不仅对人体没有副作用，还具有降低血糖水平，保持牙齿健康等功效。由于其在高温下的稳定性，它已被广泛用于烘焙产品中。到目前为止，已从甜菊叶中鉴定出64种甜菊醇糖苷，其中，甜菊苷含量最高，占干重的5-10％，其次是瑞鲍迪苷a，占干重的2-4％，是目前食品添加剂市场上应用最广泛的甜菊糖类。但是该类产品仍然存在苦涩后味等缺点，限制了其进一步的商业应用。瑞鲍迪苷d是甜菊醇糖苷家族的一员，与其他甜菊醇糖苷相比，后味不苦，甜度更高(约为蔗糖的250-350倍)，因此有可能成为新一代的优质甜味剂。
2、然而，由于在瑞鲍迪苷d在甜叶菊中含量很低，所以通过植物提取纯化的方式成本巨大，且产量远远不能够满足市场需求。因此不能采用直接从植物中提取的方式生产瑞鲍迪苷d，只能进行人工合成，而人工合成瑞鲍迪苷d需要进行糖基化反应，方式有两种：化学合成和酶法合成。化学糖基化通常需要繁琐的保护和脱保护步骤，并且具有较低的特异性和产率。而酶促糖基化表现出高效和立体和区域特异性，可以直接快速地产生糖苷键，且对环境友好。到目前为止，已有许多来源不同的糖基转移酶被鉴定出具有催化合成瑞鲍迪苷d的活性，但这些糖基转移酶普遍存在活力低下，无法耐受高底物浓度的问题。且部分酶存在副反应，会产生瑞鲍迪苷d的同系物，增加下游纯化的压力。
3、鉴于天然酶活力低下的问题，本领域急需催化活性和热稳定性提高的糖基转移酶以供瑞鲍迪苷d的生产。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变体，该糖基转移酶突变体合成瑞鲍迪苷d的活性显著提高，同时该糖基转移酶突变体的热稳定性也显著改善。
2、本发明的目的还在于提供所述糖基转移酶突变体的制备方法。
3、本发明的目的还在于提供一种利用所述糖基转移酶突变体合成瑞鲍迪苷d的方法。
4、在第一方面，本发明提供一种糖基转移酶，所述糖基转移酶在对应于野生型糖基转移酶的氨基酸序列的第129位、第208位、第20位、第69位、第150位、第238位、第273位、第287位、第349位氨基酸具有一个或多个突变。
5、在优选的实施方式中，所述野生型糖基转移酶是来源于水稻(oryza sativa)的糖基转移酶。
6、在优选的实施方式中，所述野生型糖基转移酶是来源于水稻的糖基转移酶osugt91c1。
7、在优选的实施方式中，来源于水稻的糖基转移酶osugt91c1的氨基酸序列如seqid no:3所示。
8、在优选的实施方式中，所述糖基转移酶在第129位具有突变，并且在第208位、第20位、第69位、第150位、第238位、第273位、第287位、第349位中具有1个，优选2个突变，更优选3个突变，更优选4个突变，最优选5个突变。
9、在具体的实施方式中，所述糖基转移酶在对应于野生型糖基转移酶osugt91c1的氨基酸序列中具有选自下组的突变：
10、1)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；
11、2)第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
12、3)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或酪氨酸，优选苯丙氨酸；
13、4)第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
14、5)第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
15、6)第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
16、7)第273位赖氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
17、8)第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
18、9)第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
19、10)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
20、11)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或酪氨酸，优选苯丙氨酸；
21、12)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
22、13)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
23、14)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
24、15)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
25、16)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
26、17)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
27、18)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
28、19)第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
29、20)第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
30、21)第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
31、22)第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
32、23)第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
33、24)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
34、25)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
35、26)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；
36、27)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
37、28)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
38、29)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
39、30)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
40、31)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
41、32)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
42、33)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
43、34)第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
44、35)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
45、36)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
46、37)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
47、38)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
48、39)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
49、40)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
50、41)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
51、42)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
52、43)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；
53、44)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
54、45)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
55、46)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
56、47)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
57、48)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸；
58、49)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第238位精氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；
59、50)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；第69位丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
60、51)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；第150位亮氨酸突变为色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，优选色氨酸；
61、52)第129位缬氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第20位半胱氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选丙氨酸；第208位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，优选甲硫氨酸；第273位赖氨酸突变为甘氨酸或丙氨酸，优选甘氨酸；第349位丙氨酸突变为脯氨酸；第287位甘氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，优选丝氨酸。
62、在第二方面，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编第一方面所述的糖基转移酶。
63、在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第二方面所述的核酸分子。
64、在优选的实施方式中，所述表达载体是质粒。
65、在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第三方面所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组整合有第二方面所述的核酸分子。
66、在优选的实施方式中，所述宿主细胞还包含蔗糖合酶sus1的编码核苷酸序列。
67、在优选的实施方式中，所述蔗糖合酶sus1来源于拟南芥(arabidopsisthaliana)。
68、在优选的实施方式中，所述蔗糖合酶sus1的编码核苷酸序列如seq id no:2所示。
69、在优选的实施方式中，所述宿主细胞是瑞鲍迪苷d的生产细胞。
70、在优选的实施方式中，所述宿主细胞来自埃希氏菌属(escherichia)、棒状杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium sp.)、芽孢杆菌属(bacillus)、毕赤酵母属(pichia)、酿酒酵母属(saccharomyces)、假丝酵母属(candida)、沙雷氏菌属(serratia)或弧菌属(vibrio)。
71、在优选的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)或谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)。
72、在第五方面，本发明提供一种宿主细胞的组合，所述组合包含第四方面所述的宿主细胞以及表达蔗糖合酶sus1的宿主细胞。
73、在第六方面，本发明提供一种冻干粉末，由第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述的宿主细胞的组合制成。
74、在第七方面，本发明提供第一方面所述的糖基转移酶、或第二方面所述的核酸分子、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述的宿主细胞、第五方面所述的宿主细胞的组合或第六方面所述的冻干粉末在生产瑞鲍迪苷d中的应用。
75、在第八方面，本发明提供一种制备瑞鲍迪苷d的方法，所述方法包括以下步骤：
76、a.在一培养体系中，培养第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述的宿主细胞的组合或第六方面所述的冻干粉末，使之产生瑞鲍迪苷d；和
77、b.任选从a所得的培养液中分离瑞鲍迪苷d。
78、在优选的实施方式中，步骤a的培养体系中还包含蔗糖、reb a和udp。
79、在第九方面，本发明提供一种制备reb d的方法，所述方法包括以下步骤：
80、a.在一反应体系中，利用第一方面所述的糖基转移酶催化reb a生成reb d；和
81、b.任选从以上反应体系中分离reb d。
82、在优选的实施方式中，步骤a的反应体系中还包含udpg和reb a。
83、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种糖基转移酶，所述糖基转移酶在对应于野生型糖基转移酶的氨基酸序列的第129位、第208位、第20位、第69位、第150位、第238位、第273位、第287位、第349位氨基酸具有一个或多个突变。
2.如权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶在对应于野生型糖基转移酶osugt91c1的氨基酸序列中具有选自下组的突变：
3.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编权利要求1或2所述的糖基转移酶。
4.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组整合有权利要求3所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞的组合，所述组合包含权利要求5所述的宿主细胞以及表达蔗糖合酶sus1的宿主细胞。
7.一种冻干粉末，由权利要求5所述的宿主细胞或权利要求6所述的宿主细胞的组合制成。
8.权利要求1或2所述的糖基转移酶、或权利要求3的核酸分子、或权利要求4所述的表达载体、或权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6所述的宿主细胞的组合或权利要求7所述的冻干粉末在生产瑞鲍迪苷d中的应用。
9.一种制备瑞鲍迪苷d的方法，所述方法包括以下步骤：
10.一种制备reb d的方法，所述方法包括以下步骤：
