本发明涉及生物制药，特别是涉及一种靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器及其应用。
背景技术：
1、癌症已经成为危害人类健康的重要疾病。近年来，t细胞衔接器(t cell eager，tce)成为了热门的抗体类抗肿瘤药物之一，展示了良好的抗肿瘤效果。t细胞衔接器的作用机理主要是：能同时靶向肿瘤抗原与t细胞，招募并激活t细胞，发挥t细胞的细胞毒性机制(包括细胞因子释放等)，从而杀伤肿瘤靶细胞，其已在临床上展示出良好的疗效，例如blinatumomab对cd19和cd3的双重特异性改善了b细胞淋巴瘤的治疗结果。
2、尽管取得了这些重大进展，但大多数恶性肿瘤(特别是实体瘤)仍然对免疫疗法无反应或存在较强毒副作用。主要原因之一是目前在研的tce往往以肿瘤过表达抗原为靶点，而这些抗原在正常组织也有所表达，容易出现肿瘤非特异性靶向(on-target/off-tumor)。在血液瘤中，靶向cd19、cd20抗原等虽然也会对b细胞或骨髓亚群产生损伤，但这些消耗是可承受的，只要不靶向造血干细胞，就可以不断得到补充。然而，实体瘤细胞表面过表达的抗原通常也在一些重要脏器中表达，这可能导致免疫病理学和器官衰竭，并具有潜在的死亡风险。因此，提高肿瘤选择性可以降低tce对健康细胞的毒性，从而提高其耐受性而获得更好的临床疗效。
3、靶向同一肿瘤细胞上的两种不同抗原的逻辑门控抗体可以增强治疗性抗体的功能选择性，以这种逻辑门控方式减少非特异性t细胞活化可以有效地减少由tce引起的毒性，与传统的单靶向tce相比，肿瘤双靶向tce显示出更强的疗效和更高的特异性。
4、比如，公开号为cn116239700a的专利申请公开了一种肿瘤双靶向的三特异性t细胞衔接器的制备及其应用，涉及生物制药技术领域。该发明肿瘤双靶向的三特异性t细胞衔接器在细胞水平上具有更好的特异性t细胞激活、增殖活性及t细胞抗肿瘤活性，而且能够更有效地聚集于实体瘤内部，有利于实体瘤的治疗，该发明的三特异性t细胞衔接器或其编码的基因还可用于制成抗肿瘤药物。该肿瘤双靶向的三特异性t细胞衔接器的制备方法有着制备简便且表达水平较高的优点。
5、人表皮生长因子受体2(her2)在大多数实体瘤中过表达，是肿瘤靶向药物研发首选的靶点之一。然而，her2也存在于心脏组织中，her2靶向药物容易引起心肌细胞损伤，从而导致心脏毒性，亟需开发低心脏毒性的her2靶向药物。表皮生长因子受体1(egfr)和her2同属于erbb家族，同样过表达于多种肿瘤细胞，是目前抗肿瘤领域的另一明星靶点，两者在多种肿瘤细胞中共表达，且天然能形成异二聚体。但her2与egfr的组合对于是否能够成为肿瘤双靶向tce理想的肿瘤靶点还未从报道，所以，一种靶向her2和egfr的三特异性tce有待开发。
技术实现思路
1、本发明提供了一种靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器及其应用。
2、本发明的具体的技术方案如下：
3、一种靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器，包括一个包含igg抗体恒定区的骨架，所述骨架包括两条重链和一条轻链，其中一条重链包括重链恒定区ch1、ch2、ch3，另一条重链包括ch2、ch3，轻链包括cl，所述靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器为异源三聚体，具体为：
4、第一亚基包括抗her2抗体的轻链可变区、所述骨架中的轻链以及抗cd3抗体的重链可变区及轻链可变区，第二亚基包括抗her2抗体的重链可变区及所述骨架中的一条重链，第三亚基包括抗egfr抗体的重链可变区及轻链可变区以及所述骨架中的另一条重链；
5、其中，所述第一亚基的抗her2抗体的轻链可变区和第二亚基的抗her2抗体的重链可变区构成抗her2抗体结构域，所述第一亚基中抗cd3抗体的重链可变区和轻链可变区构成抗cd3抗体结构域，所述第三亚基的抗egfr抗体的重链可变区及轻链可变区构成抗egfr抗体结构域。
6、所述igg抗体为人源igg抗体。
7、在本发明实施例中作为示例，选用所述抗cd3抗体为抗cd3ε抗体。但不限于此。
8、优选的，第二亚基和第三亚基中的两个ch3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。其中，第二亚基和第三亚基的ch2结构域引入lala-pg突变。使抗体fc片段沉默，失去与fc受体结合的功能，避免fc造成的非特异性杀伤的毒副作用。
9、具体的，当第一亚基上连接有抗cd3抗体的重链可变区和轻链可变区时，第一亚基的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.8所示，第二亚基的氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.9所示，第三亚基的氨基酸序列如seq id no.3所示。
10、本发明还提供了编码所述三特异性t细胞衔接器的基因。
11、在本发明的一些实施方案中，第一亚基的核苷酸序列如seq id no.11或seq idno.18所示，第二亚基的核苷酸序列如seq id no.12或seq id no.19所示，第三亚基的核苷酸序列如seq id no.13所示。
12、本发明还提供了所述三特异性t细胞衔接器的制备方法，包括以下步骤：(1)构建表达第一亚基的编码基因、第二亚基的编码基因和第三亚基的编码基因的编码基因载体；(2)将步骤(1)表达第一亚基的编码基因、第二亚基的编码基因和第三亚基的编码基因载体转染到哺乳动物细胞中，培养后进行蛋白纯化，得到所述三特异性t细胞衔接器。优选的，步骤(1)所述载体为plvx-puro；步骤(2)所述哺乳动物细胞为expi293f细胞。
13、本发明还提供了所述三特异性t细胞衔接器在制备抗肿瘤药物中的应用。
14、本发明还提供了所述的基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
15、本发明还提供了一种抗肿瘤药物，活性成分为所述三特异性t细胞衔接器或所述的基因。肿瘤的类型包括her2与egfr双阳性的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包括表皮癌细胞、非小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞等。
16、本发明的有益效果：
17、本发明靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器在细胞水平上具有较好的特异性t细胞激活、增殖活性及t细胞抗肿瘤活性，而且对实体瘤具有不错的疗效。因此，本发明的三特异性t细胞衔接器或其编码的基因可用于制成抗肿瘤药物。该靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器的制备方法有着制备简便且通过哺乳动物细胞表达的优点。
1.一种靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器，包括一个包含igg抗体恒定区的骨架，所述骨架包括两条重链和一条轻链，其中一条重链包括重链恒定区ch1、ch2、ch3，另一条重链包括ch2、ch3，轻链包括cl，其特征在于，所述靶向her2与egfr的三特异性t细胞衔接器为异源三聚体，具体为：
2.根据权利要求1所述的三特异性t细胞衔接器，其特征在于，所述igg抗体为人源igg抗体。
3.如权利要求1所述的三特异性t细胞衔接器，其特征在于，所述抗cd3抗体为抗cd3ε抗体。
4.如权利要求1所述的三特异性t细胞衔接器，其特征在于，第二亚基和第三亚基中的两个ch3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。
5.如权利要求4所述的三特异性t细胞衔接器，其特征在于，第二亚基和第三亚基的ch2结构域引入lala-pg突变。
6.如权利要求5所述的三特异性t细胞衔接器，其特征在于，
7.编码权利要求1～6任一所述三特异性t细胞衔接器的基因。
8.如权利要求7所述的基因，其特征在于，第一亚基的核苷酸序列如seq id no.11或seq id no.18所示，第二亚基的核苷酸序列如seq id no.12或seq id no.19所示，第三亚基的核苷酸序列如seq id no.13所示。
9.权利要求1～6任一所述三特异性t细胞衔接器或权利要求7所述的基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，活性成分为权利要求1～6任一所述三特异性t细胞衔接器或权利要求7所述的基因。
