本发明涉及药物负载生物材料，具体涉及一种pda修饰的水凝胶微球及其制备方法和应用。
背景技术：
1、小檗碱(又名黄连素)是重要的生物碱，主要用于大肠湿热，赤白下痢，里急后重或暴注下泻，肛门灼热；肠炎，痢疾见上述证候者；同时具有消炎、杀菌作用。小檗碱对多种口腔致病菌也有抑制作用，可用于防治牙周炎、龋齿，牙尖炎等。
2、然而，黄连和小檗碱的味极苦，患者难以依从，尤其是小儿。为了解决小檗碱味苦的问题，有人用载体包含物，还有人用离子交换树脂吸附等，但都难以实用。早年日本研制鞣酸小檗碱又称无味黄连素（含小檗碱25%～32%），用于肠道感染腹泻，现为我国法定药品。近年来有膜剂、凝胶剂、栓剂的专利申请，用于口腔溃疡，咽炎和妇科炎症。然而，含鞣质的中药与黄连素合用后，由于鞣质是生物碱的沉淀剂，二者结合，生成难溶性鞣酸盐沉淀，因此，会降低小檗碱的疗效；此外，因鞣酸小檗碱（无味黄连素）的主要成分为盐酸小檗碱和鞣酸，若长期或过量服用该药，可能会对胃肠黏膜造成刺激，从而引起腹痛、腹泻等症状；再有，部分患者对该药物中的成分存在过敏反应，在用药后可能会出现皮疹、瘙痒等过敏症状；最后，鞣酸小檗碱口服时吸收差，首过效应的影响也导致其较低的生物利用度，使其临床应用受到限制。
3、综上，研发一种pda修饰的水凝胶微球及其制备方法和应用，改善小檗碱直接服用“苦味”口感的同时，还有效保证小檗碱充分发挥药效，实现长效治疗效果，对小檗碱的广泛应用具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明意在提供一种pda修饰的水凝胶微球及其制备方法和应用，以解决现有小檗碱入药疗效显著降低的技术问题。
2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种pda修饰的水凝胶微球，包括小檗碱、bmp9、pda纳米微球和gelma水凝胶；pda修饰的水凝胶微球采用如下方法制备而成：先将小檗碱负载于pda纳米微球上，获得pda@bbr纳米微球；再在光引发剂存在条件下，在pda@bbr纳米微球表面交联包裹gelma水凝胶，得到gel-pda@bbr水凝胶微球；最后在gel-pda@bbr水凝胶微球中负载 bmp9，获得ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球。
3、本方案的原理和优点是：
4、本方案通过pda纳米微球吸附小檗碱后与gelma水凝胶、光引发剂交联形成gel-pda@bbr水凝胶微球，不仅有效包裹小檗碱，避免其在使用过程中遇鞣酸沉淀而降低药效；且本方案通过pda纳米微球和gelma水凝胶对小檗碱进行双层包裹负载，还能有效缓释小檗碱，延长小檗碱的治疗时间，不仅避免高频次服药下首过效应减少小檗碱的生物利用率；且还能实现小檗碱的长效治疗效果，减轻患者服药痛苦。
5、而且，发明人将同时负载了小檗碱和bmp9的水凝胶微球应用于治疗牙周炎时，ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球具有良好的促进晚期成骨效果，可以作为优秀的生物工程支架材料，促进牙周膜干细胞的成骨分化与钙结节形成；且在治疗过程中，ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球中bmp9和小檗碱协同增效，显著提升ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球对牙周膜干细胞的成骨分化效果。
6、在研发初期，申请人在采用本方案前，曾尝试先制备多微孔gelma水凝胶微球，再采用浸渍法，将多微孔gelma水凝胶微球浸入多巴胺碱性溶液中，之后经洗涤、冷冻干燥，得到多巴胺修饰的多微孔gelma水凝胶微球，再以该微球负载小檗碱，获得负载小檗碱的多微孔gelma水凝胶微球。然而，该工艺制备所得负载小檗碱的多微孔gelma水凝胶微球中，不仅小檗碱的负载量较低，且其缓释效果并不理想，无法达到要求。随后申请人再对工艺中各参数进行优化，发现依然无法获得缓释效果好的微球。
7、最后，申请人转换思路，pda微球先负载药物，再包裹水凝胶制备形成水凝胶微球，如此，不同的水凝胶和pda微球包裹顺序，使得其效果显著不同，尤其是药物负载量和缓释周期。本方案gel-pda@bbr水凝胶微球中水凝胶在外，pda微球先负载药物，再以水凝胶包裹形成更大的微球，不仅便于遇水获得凝胶状产品，且在产品达到靶向治疗点后，水凝胶易被体内细胞吸收后，负载药物的pda微球集中释放，便于提升治疗效果；且随着水凝胶逐渐被吸收，逐渐露出负载药物的pda微球，药物缓慢释放，有效延长治疗时间，缓释效果更好。
8、优选的，作为一种改进，pda纳米微球的直径为318±42nm；pda@bbr纳米微球的粒径为470±50nm；gel-pda@bbr水凝胶微球粒径为195±10μm。
9、优选的，作为一种改进，本方案还提供一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，包括如下步骤：
10、步骤一、制备pda纳米微球：
11、步骤二、pda纳米微球吸附小檗碱：将pda纳米微球-无水乙醇溶液与小檗碱-二甲基亚砜溶液混匀，静置后离心，收集沉淀，获得pda@bbr纳米微球；
12、步骤三、制备gel-pda@bbr水凝胶微球：将pda@bbr纳米微球、gelma水凝胶和光引发剂溶液混匀为水相，水相与油相进样混合后在持续光照下引发光交联反应，反应后收集微球，微球经清洗处理和干燥处理，得到gel-pda@bbr水凝胶微球。
13、优选的，作为一种改进，pda纳米微球的制备方法如下：混合去离子水、乙醇和模板剂，配置反应前溶液；配置tris溶液，混合反应前溶液、tris溶液和多巴胺单体，避光有氧条件下常温搅拌反应不少于24h，离心后超声清洗脱除模板，获得介孔聚多巴胺纳米颗粒，即pda纳米颗粒。
14、优选的，作为一种改进，pda纳米微球制备过程中，反应前溶液的制备方如下：在烧杯中搅拌均匀混合50 份的去离子水与50 份乙醇,然后称量加入0.36份模板剂pf127，再用移液枪加入0.36份模板剂tmb，混匀获得反应前溶液。
15、优选的，作为一种改进，pda纳米微球制备过程中，反应前溶液、0.01g/mltris溶液和多巴胺单体的质量比为1：1：0.01～0.1。
16、优选的，作为一种改进，pda纳米微球制备过程中，超声清洗前依次使用乙醇、丙酮各清洗纳米颗粒，超声清洗为纳米颗粒在乙醇：丙酮体积比为2:1的混合溶液中超声30～60min进行模板剔除，重复1～3次后收集纳米颗粒。
17、优选的，作为一种改进，在步骤三中，水相包括如下质量份的原料：100份gelma水凝胶冻干品、1000份lap溶液和10～20份pda@bbr微球粉末；油相为矿物油:司班80 =9: 1；水相和油相混合比为1：1，两则进样混合的进样速度均为20ul/min。
18、有益效果：本分哪敢采用上述设置，便于有效提升制备所得微球的机械性能和生物学性能。申请人通过长期实验发现，10%的gelma（即100份gelma水凝胶冻干品和1000份lap溶液）制成的水凝胶微球具有最好的机械性能和生物学性能。发明人也曾尝试调整gelma的含量，如5%，15%，20%，然而，上述比例的gelma效果均不理想，或是不够稳定无法成球，或是需要更长的光照时间固化，形成的微球过于坚硬或者弹性不好。其次，本方案搭配矿物油和司班80形成油相，其相比于现有技术中棕榈酸异丙酯组合6% em-180、或者hfe-7500电子氟化液组合2%全氟表面活性剂而言，不仅便宜易获取，且成分单一，不易反应影响结果；在完成微球交联反应后，矿物油和司班80均易被异丙醇洗掉，进一步提升微球质量。
19、优选的，作为一种改进，在步骤三中，清洗处理为依次采用pbs清洗、异丙醇清洗和乙醇清洗，每次清洗均包含加液混匀和离心弃上清步骤；每种清洗剂清洗间隙均采用pbs重新分散并静置离心后收集颗粒，再进行下一次清洗。
20、优选的，作为一种改进，gelma水凝胶的制备方法如下：将明胶分散于pbs溶液中，再在遮光条件下缓慢加入pbs溶液体积4～5%的ma，搅拌反应形成混合液；再将混合液灌入截留分子量为12～14kda的半透膜中，透析后过滤，所得沉淀冷冻干燥，获得gelma水凝胶。
21、技术效果：本方案采用上述设置，便于获得gelma水凝胶。申请人通过实验发现，配置gelma水凝胶过程中，添加pbs溶液体积4～5%的ma能保证ma过量，从而有效保证反应的完全进行，后续也可以通过透析将过量的ma小分子分离出来；而采用截留分子量为12～14kda的半透膜（如透析袋）透析则可便于反应过程中未参与反应的ma小分子透出的同时，避免gel分子透出，有效分离gelma和ma小分子，提升gelma的纯度。
22、优选的，作为一种改进，本方案还提供一种pda修饰的水凝胶微球的应用，包括pda修饰的水凝胶微球在制备治疗肠道炎症或在制备牙周炎治疗药物中的应用，制备过程如下：在gel-pda@bbr水凝胶微球上负载bmp9，制备ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球，ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球中包括1～3μg/ml小檗碱和0.3～0.5μg/ml bmp9。
23、技术效果：本方案采用上述设置，便于扩大pda修饰的水凝胶微球的应用范围。申请人通过长期实验发现，ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球具有良好的促进晚期成骨效果，可以作为优秀的生物工程支架材料，促进牙周膜干细胞的成骨分化与钙结节形成；且在治疗过程中，ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球中bmp9和小檗碱协同增效，显著提升ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球对牙周膜干细胞的成骨分化效果。
1.一种pda修饰的水凝胶微球，其特征在于：包括小檗碱、bmp9、pda纳米微球和gelma水凝胶；pda修饰的水凝胶微球采用如下方法制备而成：先将小檗碱负载于pda纳米微球上，获得pda@bbr纳米微球；再在光引发剂存在条件下，在pda@bbr纳米微球表面交联包裹gelma水凝胶，得到gel-pda@bbr水凝胶微球；最后在gel-pda@bbr水凝胶微球中负载bmp9，获得ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的一种pda修饰的水凝胶微球，其特征在于：pda纳米微球的直径为318±42nm；pda@bbr纳米微球的粒径为470±50nm；gel-pda@bbr水凝胶微球粒径为195±10μm。
3.根据权利要求2所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：pda纳米微球的制备方法如下：混合去离子水、乙醇和模板剂，配置反应前溶液；配置tris溶液，混合反应前溶液、tris溶液和多巴胺单体，避光有氧条件下常温搅拌反应不少于24h，离心后超声清洗脱除模板，获得介孔聚多巴胺纳米颗粒，即pda纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：pda纳米微球制备过程中，反应前溶液的制备方如下：在烧杯中搅拌均匀混合50份的去离子水与50份乙醇,然后称量加入0.36份模板剂pf127，再用移液枪加入0.36份模板剂tmb，混匀获得反应前溶液。
6.根据权利要求4所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：pda纳米微球制备过程中，反应前溶液、0.01g/mltris溶液和多巴胺单体的质量比为1：1：0.01-0.1。
7.根据权利要求4所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：pda纳米微球制备过程中，超声清洗前依次使用乙醇、丙酮各清洗纳米颗粒，超声清洗为纳米颗粒在乙醇：丙酮体积比为2:1的混合溶液中超声30～60min进行模板剔除，重复1～3次后收集纳米颗粒。
8.根据权利要求3所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：在步骤三中，水相包括如下质量份的原料：100份gelma水凝胶冻干品、1000份lap溶液和10～20份pda@bbr微球粉末；油相为矿物油:司班80＝9:1；水相和油相混合比为1：1，两则进样混合的进样速度均为20ul/min。
9.根据权利要求8所述的一种pda修饰的水凝胶微球的制备方法，其特征在于：在步骤三中，清洗处理为依次采用pbs清洗、异丙醇清洗和乙醇清洗，每次清洗均包含加液混匀和离心弃上清步骤；每种清洗剂清洗间隙均采用pbs重新分散并静置离心后收集颗粒，再进行下一次清洗。
10.根据权利要求9所述的一种pda修饰的水凝胶微球在制备治疗肠道炎症或在制备牙周炎治疗药物中的应用，其特征在于：所述ad-bmp9-gel-pda@bbr水凝胶微球中包括1～3μg/ml小檗碱和0.3～0.5μg/ml bmp9。
