本发明涉及大肠杆菌的检测方法，尤其涉及一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒及快速检测方法。
背景技术：
1、大肠杆菌o157:h7是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage escherichia coli,ehec)中最典型的一种，ehec o157:h7为革兰氏阴性菌、没有芽孢，有周鞭毛，大多数菌株有荚膜，对低温有较高的耐受力，且具有耐酸性，50～100个细菌即可引发感染。感染大肠杆菌o157:h7主要引起婴幼儿腹泻和出血性结肠炎，并发溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜，严重时导致死亡。大肠杆菌o157:h7传播途径多样，污染的生肉类、肉制品，未经过灭菌的牛奶，受污染的水果和蔬菜，被污染的饮用水和农田灌概水等均可引发感染疫情，其中以食源性传播为主，水源性和接触性传播也是重要的传播途径。
2、有研究通过序列分析发现大肠杆菌o157：h7的特异基因rfbe基因，并推测大肠杆菌o157:h7的rfbe基因编码甘露醇合成酶，目前检测大肠杆菌o157的pcr方法大都是以rfbe为靶基因，且免疫学检测方法也都是以此基因编码的o抗原为基础来建立的，其中的一些检测方法，如免疫分析的检测依据是利用抗原和抗体的特异性反应，该检测方法具有灵敏度高、特异性强的优点，但容易出现假阳性、假阴性；如分子生物学检测方法中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，rt-pcr)、实时荧光定量-聚合酶链式反应(real-timepolymerase chain reaction，real-time pcr)等应用比较广泛，然而pcr技术一直无法摆脱对精密仪器设备的依赖、高洁净度要求的操作条件、反应时间过长等局限。
技术实现思路
1、本发明为解决以上背景技术中提到的问题，提供一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒及快速检测方法，以解决现有技术的问题。
2、本发明采用的技术方案是：
3、一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒，包括预处理试剂和检测试剂，其中检测试剂中包括针对大肠杆菌o157：h7特异基因rfbe基因进行检测的lamp扩增特异性f3、b3、fip、bip引物组，各引物的碱基序列为：
4、f3：ccagttagaacaagctgatga；
5、b3：ggccttgtttcgatgagtt；
6、fip：cttgtggacttgtacaagactgt-cgaaaacgtgaaattgctga；
7、bip：ttcacacttattggatggtctcaat-ggtgattccttaattcctctct。
8、进一步地，所述f3、b3、fip、bip引物组中外引物f3和b3各含0.2μmol/l，内引物fip和bip各含1.6μmol/l。
9、进一步地，所述检测试剂还包括8u bst dna聚合酶、1.4mmol/l dntps、6mmol/lmgso4、1x lamp buffer、1x lamp荧光染料、dna模板、ddh2o。
10、进一步地，所述预处理试剂包括100μl 50mm naoh和100μl 50mm hcl、100μl0.5％tritonx-100中的一种。
11、一种基于lamp的大肠杆菌快速检测方法，包括以下步骤：
12、s1样本预处理
13、用预处理试剂进行样本预处理方法提取到dna模板；
14、s2 lamp扩增引物的筛选
15、将得到的dna模板与检测试剂混合，其反应体系为20μl，包括f3、b3、fip、bip引物组，bst聚合酶，dntps，mgso4，10x lamp buffer，lamp荧光染料，dna模板，ddh2o，lamp反应体系配制好后放入qpcr仪中，设置程序为65℃，40min，筛选出合适的扩增引物；
16、s3 lamp扩增检出限
17、检测该引物对大肠杆菌o157：h7的检出限，用蒸馏水将大肠杆菌稀释为不同浓度的菌液，采用预处理试剂提取菌液dna，以该dna模板为靶标进行la mp扩增检测，通过观察扩增信号的产生来获得该引物的检出限；
18、进一步地，还包括大肠杆菌的培养及计数以确定菌液浓度，将大肠杆菌菌种接种于已灭菌的lb培养基中，37℃，200r/min摇床震荡培养过夜，将菌液用蒸馏水按10倍梯度稀释，取50μl稀释后的菌液在lb固体培养基中进行涂布，放入恒温培养箱中，37℃培养过夜，记录平板菌落数。
19、进一步地，所述步骤s3中样品预处理包括碱加热裂解法，加入100μl 50mm naoh后混匀，置于金属浴上95℃加热10min，加入100μl 50mm hcl中和，随后12000rpm/min，25℃离心3min，收集上清作为dna模板。
20、进一步地，所述步骤s3中样品预处理还包括tritonx-100+热裂解法，加入100μl0.5％tritonx-100混匀，置于金属浴上95℃加热10min，随后12000rpm/mi n，25℃离心3min，收集上清作为dna模板。
21、进一步地，用样品预处理后得到的dna模板的测得大肠杆菌的lamp扩增检出限为101cfu/ml。
22、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23、本发明利用生物信息学确定大肠杆菌特异基因，并针对该基因设计引物，建立了一种基于lamp扩增的大肠杆菌快速检测方法，实现了具有快速、简易、高特异性、不依赖于昂贵仪器设备的优点，实验表明碱加热裂解法提取的dna样本检测效果最好，tritonx-100加热裂解法提取的dna样本检测时ct值偏大，检测时间比碱加热裂解法长一点，两种方法的lamp扩增的检出限均达到101cfu/ml，与商品化细菌基因组dna提取试剂盒提取所得菌液样本dna的检测限一致。且碱加热裂解法所用试剂对lamp反应体系无明显影响，处理菌液样品时不需要任何浓缩步骤，减少了样本损失，大大缩短了样品预处理时间(10min)，显著优于细菌基因组dna提取试剂盒(90min)。lamp扩增对碱加热裂解法提取的实际菌液样本dna进行检测时，灵敏度、特异性和总符合率高。本研究所建立的碱加热裂解法提取菌液样本dna时所需试剂简单，且不依赖于大型仪器，检测成本降低，可实现集成的现场快速检测，为开展食源性致病微生物的现场检测提供技术支持。
1.一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括预处理试剂和检测试剂，其中检测试剂中包括针对大肠杆菌o157：h7特异基因rfbe基因进行检测的lamp扩增特异性f3、b3、fip、bip引物组，各引物的碱基序列为：
2.根据权利要求1所述的一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述f3、b3、fip、bip引物组中外引物f3和b3各含0.2μmol/l，内引物fip和bip各含1.6μmol/l。
3.根据权利要求1所述的一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂还包括8u bst dna聚合酶、1.4mmol/l dntps、6mmol/lmgso4、1x lamp buffer、1xlamp荧光染料、dna模板、ddh2o，同时用无污染的无酶水代替dna模板设置一个阴性对照。
4.根据权利要求1所述的一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述预处理试剂包括100μl 50mm naoh和100μl 50mm hcl。
5.根据权利要求1所述的一种基于lamp的大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述预处理试剂包括100μl 0.5％tritonx-100。
6.一种基于lamp的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求4所述的一种基于lamp的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，还包括大肠杆菌的培养及计数以确定菌液浓度，将大肠杆菌菌种接种于已灭菌的lb培养基中，37℃，200r/min摇床震荡培养过夜，将菌液用蒸馏水按10倍梯度稀释，取50μl稀释后的菌液在lb固体培养基中进行涂布，放入恒温培养箱中，37℃培养过夜，记录平板菌落数。
8.根据权利要求4所述的一种基于lamp的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤s1中样品预处理包括加入100μl 50mm naoh后混匀，置于金属浴上95℃加热10min，加入100μl 50mm hcl中和，随后12000rpm/min，25℃离心3min，收集上清作为dna模板。
9.根据权利要求4所述的一种基于lamp的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤s1中样品预处理还包括加入100μl 0.5％tritonx-100混匀，置于金属浴上95℃加热10min，随后12000rpm/min，25℃离心3min，收集上清作为dna模板。
10.根据权利要求7或8所述的一种基于lamp的大肠杆菌快速检测方法，其特征在于，用样品预处理后得到的dna模板的测得大肠杆菌的lamp扩增检出限为101cfu/ml。
