本技术涉及转录组文库构建，更具体地说，涉及一种链特异性转录组文库构建的方法。
背景技术：
1、转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，该技术已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发领域。随着新一代测序平台的市场化，rna测序(rna sequenclng，rna-seq)技术已成为了转录组学研究的重要手段之一。
2、传统的rna建库包含mrna的富集、mrna的片段化、第一链cdna的合成、第二链cdna的合成及双链cdna合成后的纯化、末端修复和加a、接头连接及接头连接后纯化、文库扩增及纯化，步骤多，时间长。为了节省建库时间，当前主流的解决方法是将第二链cdna的合成及双链cdna合成后的纯化、末端修复和加a磷酸化三个过程合并为一个步骤，但该方法还不够快速。
3、另外，在进行链特异性转录组建库时目前较为普遍的方法是在第一链cdna合成时加入对人体有害的放线菌素d以抑制第二链cdna的合成，给人体健康带来风险。
技术实现思路
1、为了进一步提升建库速度，同时减少对人体有害的有毒试剂的使用，本技术提供一种链特异性转录组文库构建的方法，本方法具有安全快速、节省成本、操作简便的优点。
2、本技术采用的技术方案为：一种链特异性转录组文库构建的方法，包括以下步骤：(1)富集待测样本中的mrna；(2)将富集的mrna进行片段化处理；(3)以片段化的mrna为模板，在一个合成反应液中连续合成第一链cdna和第二链cdna，生成了双链cdna，继续在所述合成反应液中进行双链cdna的末端修复以及加a；(4)将加a后的双链cdna与接头连接，得到接头连接产物；(5)对所述接头连接产物进行文库扩增。
3、通过采用上述技术方案，本方法在同一个合成反应液中，一步完成第一链cdna、第二链cdna的合成、双链cdna片段的末端修复、和双链cdna片段的末端加a反应，无需使用链特异性转录组建库过程中常用的有毒试剂放线菌素d，步骤少，建库时间短，节省成本、操作简便。
4、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(2)mrna的片段化包括：使用含有mg2+的片段化缓冲液和mrna混合，加热至94℃～85℃保持5～10min，使得mrna被随机打断成150～700bp的mrna片段，然后进行退火。
5、通过采用上述技术方案，片段mrna逆转录的双链cdna结构更稳定更有利于扩增。退火使得引物和mrna恢复活性，以进行后续的逆转录合成dna。退火可以采用在室温环境下直接降温至60℃完成，然后可以4℃保存。
6、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(2)中，所述片段化缓冲液含有mg2+的浓度为50～100mm，所述片段化缓冲液还含有3～50μm的5′端磷酸化的随机引物n6～n8、0.5～3mm的dntps、100～300mm ph8.0～9.0的trishcl、200～400mm的kcl和5～20mm的dtt。
7、通过采用上述技术方案，5′端磷酸化的随机引物n6～n8、dntps、trishcl、kcl和dtt均可以用于第一链cdna的合成。5′端磷酸化的随机引物更有亲和性，有利于第一链cdna的合成。
8、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(3)的合成反应液包括合成缓冲液和合成酶溶液。
9、通过采用上述技术方案，为cdna的合成提供原料和催化酶。
10、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，所述合成缓冲液包含：100～250mm ph8.6～9.0trishcl、50～100mm mgcl2、120～500mm kcl、10～20mm dntps和1～5mm dtt。
11、通过采用上述技术方案，trishcl为合成cdna提供稳定的ph环境。mg2+、dntps和cdna结合成复合体，从而被合成酶识别而合成dna链。k+可以促进引物和cdna结合，保持合成酶在高温下的活性。dtt作为巯基化cdna的还原剂和去保护剂，可以降低cdna的二聚化。
12、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，所述合成酶溶液包含1～2u/μl m-mlv(rnaseh-)、0.5～2u/μl rnase inhibitor、1～2u/μl rnaseh、2～6u/μlklenow、1～2u/μl t4 dna聚合酶和5～10u/μl klenow片段(3′→5′exo-)。
13、通过采用上述技术方案，m-mlv(rnaseh-)催化合成一链cdna，rnaseh、klenow催化合成二链cdna，t4 dna聚合酶对二链cdna进行末端修复，klenow片段(3′→5′exo-)对二链cdna进行末端加a。
14、其中，klenow相比于klenow片段(3′→5′exo-)：klenow保留有3′→5′核酸外切酶的活性；klenow片段(3′→5′exo-)去除了3′→5′核酸外切酶的活性，不适用于生成平末端的反应。
15、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(3)通过将片段化的mrna溶液、所述合成缓冲液和所述合成酶溶液混合，并且按照反应程序20～30℃保持5～10min，再40～45℃保持10～30min，最后70～75℃保持10～20min，来连续合成第一链cdna和第二链cdna以得到双链cdna，以及对得到的双链cdna进行末端修复和加a。
16、通过采用上述技术方案，一步连续完成第一链cdna和第二链cdna的合成，得到双链cdna，同时对得到的双链cdna进行末端修复和加a，过程无需使用链特异性转录组建库过程中常用的有毒试剂放线菌素d，建库时间短，节省成本、操作简便、安全。
17、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(3)中，混合反应的所述片段化的mrna溶液、所述合成缓冲液和所述合成酶溶液的体积比为(15～25):(5～10):(35～40)。
18、通过采用上述技术方案，各成分以适当比例进行合成反应，合成反应效率高。
19、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(4)将加a后的双链cdna与接头连接，得到接头连接产物，是通过将加a后的双链cdna溶液和接头溶液混合并加入接头缓冲液和连接酶溶液，15～25℃保持10～30min得到的。所述接头缓冲液包括50～200mm ph7.2～7.8的trishcl、20～100mm mgcl2、10～50mm atp和5～30％peg8000(v/v)；所述连接酶溶液包含200～400u/μl的tianseq dna ligase。所述双链cdna溶液、所述接头溶液、所述接头缓冲液和所述连接酶溶液的体积比为(60～70):(1～10):(10～30):(5～15)。
20、通过采用上述技术方案，trishcl为接头连接提供稳定的ph环境。以上浓度的原料使得双链cdna连接接头的连接反应更为高效。双链cdna连接接头后可以进行后续的扩增。
21、作为该链特异性转录组文库构建的方法的一种优选方案为，步骤(5)对所述接头连接产物进行文库扩增，是将纯化的所述接头连接产物和2×hifi pcrmaster mix、p5/p7primers mix共同混合，加热至98℃保持2min，并进行12～20cycles的程序升降温反应，最后72℃保持1min完成扩增过程；所述程序升降温反应的参数为98℃保持20s，然后60℃保持30s，最后72℃保持30s。
22、通过采用上述技术方案，2×hifi pcrmaster mix为扩增酶来源，p5/p7 primersmix为引物来源，使得连接接头后的双链cdna扩增。
23、综上所述，本技术的链特异性转录组文库构建的方法具有如下有益效果：本技术的链特异性转录组文库构建的方法，将一链cdna合成、二链cdna合成及双链cdna的末端修复、加a多个过程合并，无需使用链特异性建库过程中常用的有毒试剂放线菌素d，建库时间短，节省成本、操作简便。
1.一种链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于，步骤(2)mrna的片段化包括：使用含有mg2+的片段化缓冲液和mrna混合，加热至94℃～85℃保持5～10min，使得mrna被随机打断成150～700bp的mrna片段，然后进行退火。
3.根据权利要求2所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述片段化缓冲液含有mg2+的浓度为50～100mm，所述片段化缓冲液还含有3～50μm的5′端磷酸化的随机引物n6～n8、0.5～3mm的dntps、100～300mm ph8.0~9.0的trishcl、200～400mm的kcl和5～20mm的dtt。
4.根据权利要求1所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：步骤(3)的合成反应液包括合成缓冲液和合成酶溶液。
5.根据权利要求4所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：所述合成缓冲液包含：100～250mm ph8.6~9.0 trishcl、50～100mm mgcl2、120～500mm kcl、10～20mmdntps和1～5mm dtt。
6.根据权利要求4所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：所述合成酶溶液包含1～2u/μl m-mlv（rnaseh-）、0.5～2u/μl rnase inhibitor、1～2u/μl rnaseh、2～6u/μl klenow、1～2u/μl t4 dna聚合酶和5～10u/μl klenow片段（3′→5′exo-）。
7.根据权利要求4~6任一项所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：步骤(3)通过将片段化的mrna溶液、所述合成缓冲液和所述合成酶溶液混合，并且按照反应程序20~30℃保持5～10min，再40~45℃保持10～30min，最后70~75℃保持10～20min，来连续合成第一链cdna和第二链cdna以得到双链cdna，以及对得到的双链cdna进行末端修复和加a。
8.根据权利要求7所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：步骤(3)中，混合反应的所述片段化的mrna溶液、所述合成缓冲液和所述合成酶溶液的体积比为（15~25）:（5~10）:（35~40）。
9.根据权利要求1所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：步骤(4)将加a后的双链cdna与接头连接，得到接头连接产物，是通过将加a后的双链cdna溶液和接头溶液混合并加入接头缓冲液和连接酶溶液，15~25℃保持10～30min得到的；
10.根据权利要求1或9所述的链特异性转录组文库构建的方法，其特征在于：步骤(5)对所述接头连接产物进行文库扩增，是将纯化的所述接头连接产物和2×hifi pcrmastermix、p5/p7 primers mix共同混合，加热至98℃保持2min，并进行12~20cycles的程序升降温反应，最后72℃保持1min完成扩增过程；所述程序升降温反应的参数为98℃保持20s，然后60℃保持30s，最后72℃保持30s。
