本发明涉及药学，尤其是长春西汀在制备促进血管新生药物中的应用。
背景技术：
1、脑血管疾病是脑血管病变导致脑功能障碍的一类疾病的总称。脑卒中(stroke)为脑血管疾病的主要临床类型，为一组器质性脑损伤导致的脑血管疾病。据中国疾病预防控制中心对我国排名前25位死因及导致死亡的高危因素分析，脑卒中是目前导致人类死亡的第一位原因。
2、脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中最常见的类型是缺血性脑卒中，约占70-80％。脑缺血发生后会产生局部缺血灶，包括中心坏死区和周围缺血半暗带区，中心坏死区神经细胞大量死亡，而缺血半暗带区神经功能虽然受损，但若能在短时间内迅速恢复血供或其他有效治疗，则该区脑组织的损伤是可逆的，神经细胞有可能存活并恢复功能。
3、长春西汀(vinpocetine)由匈牙利的gedeon richter药物公司研发，并于1978年上市，pde1a是长春西汀被发现的第一个药物作用靶点，主要调节血管平滑肌细胞内cgmp的水平进而调节血管平滑肌的紧张性，抑制pde1a可通过激活cgmp-pkg途径舒张血管平滑肌，导致脑血管阻力降低从而增加脑血流量，改善脑血流量和耗氧量，增强葡萄糖和氧气供应以及atp生成，从而改善大脑代谢[21]。课题组前期偶然发现长春西汀可以促进血管内皮细胞的小管形成，而内皮细胞的小管形成是血管新生过程中的关键步骤之一。
技术实现思路
1、本发明的目的是：发现长春西汀在制备促进血管新生药物中的应用。
2、本发明发现了长春西汀在制备促进血管新生药物中的应用。
3、1、吲哚生物碱在治疗缺血性脑卒中新作用机制研究方法包括：建立hbmec细胞ogd/r模型，cck8、细胞划痕实验、小管形成实验、试剂盒检测细胞中cgmp含量、westernblot、elisa等实验。
4、细胞的培养条件：
5、hbmec细胞传代培养，培养条件为含有青霉素(终浓度为100u/ml)、链霉素(终浓度为100μg/ml)、ecgs(终浓度为40μg/ml)以及10％ fbs的dmem/f12培养基，当细胞融合至90％时，弃去旧培养基，用2ml pbs洗涤细胞2次，弃去pbs后加入2ml 0.25％胰蛋白酶-0.02％ edta混合消化液，置显微镜下观察，约30s，当细胞变圆后迅速加入2ml完全培养基终止消化，轻轻吹打，收集细胞。800rpm，4℃，离心5min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞，分瓶培养，隔天换液。
6、ogd/r细胞模型建立：
7、选取生长到第7d左右的细胞进行体外ogd/r模型。调节细胞密度，以4x104的细胞密度接种于12孔培养板中。首先将培养基更换为pbs缓冲液，同时将细胞置于含有5％ co2、95％ n2三气恒温培养箱中培养2h，完成缺氧过程；随后将细胞培养基更换为含2％ b27的neurobasal培养基，置于含有5％ co2、20％ o2恒温培养箱中培养24h，完成复氧过程，复氧同时按照实验分组加入不同浓度的长春西汀以及dt-3。
8、2、根据权利要求一所述吲哚生物碱在治疗缺血性脑卒中新作用机制研究的cck8实验，其实验方法如下：离心收集取各组细胞，以1×104/孔的密度接种到96孔板中，每组设3个复孔，按分组情况进行相应处理，处理结束后，采用cck-8进行测定：pbs冲洗3次，每孔添加100μl含血清培养基，同时加入50μl cck-8工作液，轻轻摇晃均匀，放入细胞培养箱进行孵育。孵育2h后，取出96孔板，使用微量移液枪将测试孔液体轻轻吹打均匀，保证同一条件下，将测试孔中的液体吸取100μl加入到新的96孔板中，通过酶标仪在波长450nm处检测各自的吸光度值，并进行相应的比较分析。
9、3、根据权利要求一所述吲哚生物碱在治疗缺血性脑卒中新作用机制研究的细胞划痕实验，实验方法如下：1)划痕实验：待细胞增殖至6孔板80％-90％时，弃净培养基，加入丝裂霉素溶液5μg/ml，37℃常规培养箱静置1h，按照实验分组进行相应处理后，吸净孔内液体，加入1ml pbs溶液，以钢尺为标准，10μl枪头垂直于板面以及背侧横线划竖线，弃净孔内液体，pbs轻轻冲洗3次。按照分组分别加入2ml含1％ fbs的完全培养基，置于37℃培养箱中常规培养。2)摄片：于划痕后0h、24h于显微镜下摄片并记录摄片坐标，通过标记背侧面平行线位置，保证每次拍摄部位一致。3)分析：以imagej软件分析每组细胞划痕面积，计算24h划痕愈合百分比，重复三次实验。
10、4、western blot实验，细胞核蛋白和细胞浆蛋白提取1)用pbs清洗细胞一遍，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。2)每20微升细胞沉淀加入200微升添加了pmsf的细胞浆蛋白抽提试剂a。
11、3)最高速剧烈vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。4)冰浴10-15分钟。5)加入细胞浆蛋白抽提试剂b10微升。最高速剧烈vortex 5s，冰浴1分钟。6)最高速剧烈vortex 5秒，4℃12000-16000g离心5分钟。7)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。8)对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了pmsf的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)9)最高速剧烈vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈vortex15-30秒，共30分钟。10)4℃12000-16000g离心10分钟。11)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。
12、5、所述吲哚生物碱在治疗缺血性脑卒中新作用机制研究的体内实验实验方法以及选材如下：
13、材料选取：
14、spf级sd大鼠体重200-220g，雄性，8周龄；体重200±20g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物合格证号：scxk(苏)2021-0013，饲养于spf级环境中，室内温度控制在23±2℃，自由饮食和摄水，实验动物使用许可证号：syxk(黔)2021-0005。
15、模型及给药方法：
16、将大鼠腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，仰卧位固定在实验台上,颈正中切口,手术刀切开皮肤，钝性分离各层组织,按照大鼠颈部血管解剖图，于体视显微镜下分离左颈总动脉(cca)，置线备用向上分离左颈外动脉(eca)和颈内动脉，双重结扎，剪断甲状腺上动脉及枕动脉两条颈外动脉分支，在近cca分叉约5mm-8mm处双重结扎eca，于ica及cca近心端分别用微动脉夹夹闭,在eca近分叉处留置一打好单结但不收紧的丝线，在eca近端结扎处与颈总动脉分叉处之间做一直径约0.2mm的v型微切口,将尼龙线头自切口处轻轻插入，轻轻收紧线结,将颈内动脉于两结扎线间剪断,使之与颈内动脉方向一致松开动脉夹，将尼龙线顺eca经ica送入颅内，插入深度约18mm～20mm微遇阻力时停止，使尼龙线头端位于mca起始处，阻断mca的血流收紧丝线,缝合切口，留置尼龙线尾端于体外。
17、缺血1.5小时后，用10％水合氯醛再次麻醉大鼠，轻轻拉动尼龙线使其头端回到微切口处(略有阻力感)，使大脑中动脉恢复血供，进行再灌注。假手术组大鼠只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管及导入线栓，术后动物保温。再灌注1小时候，大鼠按照分组方式进行给药。
18、通过采用上述技术方案，本发明的发明人通过一系列的深入研究发现长春西汀作为pde1a抑制剂可以通过cgmp-pkg途径协同hif-1α-vegf途径，在体外促进ogd/r模型人脑微血管内皮细胞的小管形成和迁移，在体内降低mcao/r模型大鼠脑梗死面积并显著增加缺血半暗带的血管密度和新生血管数，进而促进缺血诱导的血管新生，长春西汀用于治疗缺血性脑卒中将产生一靶双效，“1+1＞2”的叠加作用效果。
1.长春西汀在制备促进血管新生药物中的应用。
