背景技术：
1、目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的分析物如多核苷酸(如dna或rna)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。
2、跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的dna测序技术的纳米孔得到了许多关注。
3、当跨纳米孔施加电势时，当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述分析物如核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，所述分析物如单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述分析物如多核苷酸穿过所述孔的移动。
4、在现有的纳米孔测序技术中，需要先将多核苷酸结合蛋白与测序接头组装，形成用于纳米孔测序的测序接头复合物，之后用连接酶将该测序接头复合物与待测序列连接起来，从而形成测序文库，完成后续的测序。
5、现有技术需要制备测序接头复合物，测序接头复合物一般是蛋白-核酸形成的复合物，该复合物在存储以及运输中会面临稳定性较低的状况，比如接头复合物中的酶在长时间存储中易脱落等；并且制备过程中会有一定比例的原料损耗。此外，现有技术中制备测序文库的方法操作复杂。
技术实现思路
1、本发明人首次发现不需制备相应的接头复合物，只需在制备测序文库时将多核苷酸结合蛋白、测序接头以及待测序列等直接进行混合可得到待测序文库。这种建库方法无需提前制备接头复合物，并且操作简便。
2、因此，本发明的第一方面涉及一种测序文库的制备方法，所述方法包括：
3、(a)提供测序接头、多核苷酸结合蛋白和分析物；以及
4、(b)使所述测序接头、所述多核苷酸结合蛋白和所述分析物混合，从而连接形成测序文库，所述测序文库中，所述测序接头与所述分析物连接，并且所述多核苷酸结合蛋白保持结合到所述测序接头。
5、优选地，在步骤(b)之前，所述多核苷酸结合蛋白未结合到所述测序接头上。
6、优选地，在步骤(b)结束时，所述分析物与所述测序接头连接，并且所述多核苷酸结合蛋白结合并停滞在所述测序接头处。
7、优选地，所述混合在同一体系中进行，和/或，所述混合为同时混合。
8、在一些实施方式中，所述测序接头包含用于结合多核苷酸结合蛋白的结合区。优选地，所述结合区包含单链多核苷酸，其中所述多核苷酸结合蛋白具有控制多核苷酸移位的能力且具有降低的使双链多核苷酸解旋能力。
9、在一些实施方式中，所述测序接头包含用于结合多核苷酸结合蛋白的结合区和用于停滞多核苷酸结合蛋白的间隔器。优选地，所述结合区包含单链多核苷酸，所述间隔器包含使一个或多个多核苷酸结合蛋白停滞的任何分子或分子组合。
10、在一些实施方式中，所述测序接头包含用于同时结合并停滞多核苷酸结合蛋白的阻滞带。优选地，所述阻滞带包含由多个核苷酸连接形成的单链核苷酸序列，所述核苷酸的核碱基为苯并结构。
11、优选地，所述测序接头与所述分析物的连接在连接体系中进行，所述连接体系为酶连接体系或点击化学连接体系。
12、在一些实施方案中，所述连接采用酶连接体系，所述酶连接体系包含连接酶。
13、优选的，所述连接酶是以ntp，优选atp为底物的酶，更优选地，所述连接酶选自t4dna连接酶、大肠杆菌dna连接酶、taq dna连接酶、tma dna连接酶、9°n dna连接酶或其任意组合；最更优选为t4 dna连接酶。
14、优选地，如果采用二硫键形式进行分子内共价交联，所述连接体系中还包含分子内交联剂，优选地，所述分子内交联剂选自tmad、oxygen、gssg(氧化型谷胱甘肽)或其任意组合。在连接体系中，所述分子内交联剂的浓度为0-1m，优选1μm-500mm，更优选10μm-1mm。优选地，分子内交联剂的浓度为10、20、50、100、125、150、200μm。
15、优选地，所述酶连接体系还包含ntp，优选atp。
16、优选地，所述酶连接体系还包含促进酶活性的金属阳离子，优选，mg2+。
17、在一些实施方案中，所述连接采用点击化学连接体系，所述测序接头通过点击化学反应与分析物连接。点击化学反应(click chemistry)为通过小单元的拼接，来快速地完成不同分子的化学合成。在优选的实施方案中，测序接头上连接有第一连接基团，分析物上连接有第二连接基团，通过第一连接基团和第二连接基团发生点击化学反应，实现分析物和测序接头的快速连接。第一连接基团和第二连接基团可以是通过碳碳多键加成反应连接、通过亲核开环化反应连接、通过环加成反应等点击化学反应。例如：第一连接基团和第二连接基团中一个可以是环辛烯(tco)、二苯并环辛炔(dbco)、二氟化环辛炔(difo)、二环壬炔(bcn)或二苯并环辛炔(dico)中的任意一种；另一个可以是叠氮基(n3)、四嗪基(tz)等。本领域技术人员可以理解的是，本实施方案不限定第一连接基团和第二连接基团具体为哪种可发生点击化学反应的基团。
18、优选地，所述多核苷酸结合蛋白选自聚合酶、解旋酶、核酸外切酶、和拓扑异构酶中的任一种或两种以上组合。
19、优选地，所述多核苷酸结合蛋白为解旋酶，更优选地，所述解旋酶为(a)hel308解旋酶、recd解旋酶、xpd解旋酶或dda解旋酶；(b)衍生自(a)中所述任一解旋酶；或(a)和/或(b)中所述解旋酶的任意组合。
20、优选地，所述测序接头是用于与所述多核苷酸结合蛋白结合并且与所述分析物连接的由多个核苷酸连接形成的接头。所述测序接头可以是y衔体；所述y衔体包含优先螺入孔中的前导序列。所述测序接头还可以是桥连部分；所述桥连部分是发夹环。
21、优选地，所述测序接头包含能够耦合到膜的锚。
22、优选地，所述分析物选自多核苷酸、多肽、脂质或多糖，优选多核苷酸，所述多核苷酸是完全双链多核苷酸、部分双链多核苷酸或单链多核苷酸。
23、当分析物为多核苷酸时，在多核苷酸测序文库的制备过程中，使测序接头直接与多核苷酸连接，从而形成多核苷酸测序文库。
24、当分析物为多肽时，在多肽测序文库的制备过程中，首先将多肽与核酸连接获得核酸-多肽连接物，然后使测序接头与核酸-多肽连接物连接，从而形成多肽测序文库。
25、本发明的第二方面涉及一种构建体，所述构建体由根据本发明第一方面的方法制备得到，所述构建体包括：所述测序接头、所述多核苷酸结合蛋白和所述分析物，所述测序接头与所述分析物连接，并且所述多核苷酸结合蛋白保持结合到所述测序接头。
26、本发明的第三方面涉及一种表征分析物的方法，所述方法包括：
27、(i)实施根据本发明第一方面的测序文库的制备方法，从而形成测序文库或构建体；
28、(ii)将在步骤(i)中形成的测序文库或构建体与跨膜孔接触，使得多核苷酸结合蛋白控制所述分析物相对于所述跨膜孔的移动；以及
29、(iii)随着所述分析物相对于所述跨膜孔的移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述分析物的一个或多个特征，且由此表征所述分析物。
30、优选地，所述跨膜孔是蛋白孔或固态孔；更优选地，所述蛋白孔衍生自msp、a-溶血素(a-hl)、胞溶素、csgg、clya、sp1或frac。
31、优选地，所述膜是两亲层或固态层；更优选地，所述两亲层是脂双层。
32、本发明的第四方面涉及一种用于制备测序文库的试剂盒，其包含独立包装的测序接头、独立包装的多核苷酸结合蛋白和独立包装的任选的连接体系。
33、本发明的第五方面涉及一种用于表征分析物的试剂盒，其包含独立包装的测序接头、独立包装的多核苷酸结合蛋白和独立包装的任选的连接体系。更优选地，所述试剂盒还包含跨膜孔和膜。
34、优选地，所述多核苷酸结合蛋白选自聚合酶、解旋酶、核酸外切酶和拓扑异构酶中的任一种或两种以上组合；更优选地，所述多核苷酸结合蛋白为解旋酶，所述解旋酶为(a)hel308解旋酶、recd解旋酶、xpd解旋酶或dda解旋酶；(b)衍生自(a)中所述任一解旋酶；或(a)和/或(b)中所述解旋酶的任意组合。所述连接体系还包含ntp，优选atp；还包含促进酶活性的金属阳离子，优选，mg2+。所述连接酶选自t4 dna连接酶、大肠杆菌dna连接酶、taqdna连接酶、tma dna连接酶、9°n dna连接酶或其任意组合；更优选为t4 dna连接酶。所述分子内交联剂选自tmad、oxygen、gssg(氧化型谷胱甘肽)或其任意组合。所述跨膜孔是蛋白孔或固态孔；更优选地，所述蛋白孔衍生自msp、a-溶血素(a-hl)、胞溶素、csgg、clya、sp1或frac。所述膜是两亲层或固态层；更优选地，所述两亲层是脂双层。
35、优选地，在根据本发明第四方面和第五方面的试剂盒中，所述测序接头用于与所述多核苷酸结合蛋白结合并且与分析物连接；所述多核苷酸结合蛋白用于控制所述分析物相对于跨膜孔的移动；所述连接体系用于使测序接头、多核苷酸结合蛋白和分析物在其中混合并且使所述测序接头与所述分析物连接以及使所述多核苷酸结合蛋白保持结合到所述测序接头上。
36、本发明的第六方面涉及如第一和第三方面提供的方法或如第四和第五方面提供的试剂盒在制备表征分析物的产品或表征分析物中的应用。
37、本发明的技术方案取得了以下技术效果：
38、本发明的方法不需要预先制备测序接头复合物，各组分(如多核苷酸结合蛋白，核酸接头)的存储稳定性进一步加强。这种建库方式操作简单，无需对接头复合物进行纯化，节约时间。
39、此外，通常情况下，使用连接酶连接建库时使用的连接体系中存在连接酶底物ntp如atp和镁离子，多核苷酸结合蛋白如解旋酶会消耗ntp如atp并且在测序接头上运动。因此，在多核苷酸结合蛋白如解旋酶与连接酶共存的连接体系中，多核苷酸结合蛋白如解旋酶可能会消耗连接酶的底物，从而影响连接酶的功能；而连接体系中存在的ntp如atp会造成多核苷酸结合蛋白如解旋酶提前在测序接头上运动，从而可能会造成测序文库构建失败。但是，发明人惊讶地发现在测序文库制备的过程中，当将测序接头、多核苷酸结合蛋白和分析物三者一同置入连接酶存在的连接体系(还含有atp以及镁离子)中时，多核苷酸结合蛋白(如解旋酶)也能够很好地连接到测序接头上。在将三者一同置入连接酶存在的连接体系中时，解旋酶连接到测序接头上，并且解旋酶的连接与t4连接酶的连接互不干扰可同时进行，所形成的测序文库的质量不受影响。
40、在点击化学连接体系中，解旋酶的连接与点击化学体系中的连接基团以及各种化学反应与也互不干扰。
1.一种测序文库的制备方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述多核苷酸结合蛋白未结合到所述测序接头上；
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述混合在同一体系中进行，和/或，所述混合为同时混合。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白选自聚合酶、解旋酶、核酸外切酶和拓扑异构酶中的任一种或两种以上组合。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白为解旋酶，优选地，所述解旋酶为(a)hel308解旋酶、recd解旋酶、xpd解旋酶或dda解旋酶；(b)衍生自(a)中所述任一解旋酶；或(a)和/或(b)中所述解旋酶的任意组合。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述测序接头是用于与所述多核苷酸结合蛋白结合并且与所述分析物连接的由多个核苷酸连接形成的接头。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述测序接头包含能够耦合到膜的锚。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分析物选自多核苷酸、多肽、脂质或多糖，优选多核苷酸，所述多核苷酸是完全双链多核苷酸、部分双链多核苷酸或单链多核苷酸。
9.一种构建体，所述构建体由包括权利要求1-8中任一所述方法制备得到，所述构建体包括：所述测序接头、所述多核苷酸结合蛋白和所述分析物，所述测序接头与所述分析物连接，并且所述多核苷酸结合蛋白保持结合到所述测序接头。
10.一种表征分析物的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述跨膜孔是蛋白孔或固态孔；优选地，所述蛋白孔衍生自msp、a-溶血素(a-hl)、胞溶素、csgg、clya、sp1或frac；和/或，所述膜是两亲层或固态层；优选地，所述两亲层是脂双层。
12.一种用于制备测序文库的试剂盒，其包含独立包装的测序接头、独立包装的多核苷酸结合蛋白和独立包装的任选的连接体系。
13.一种用于表征分析物的试剂盒，其包含独立包装的测序接头、独立包装的多核苷酸结合蛋白和独立包装的任选的连接体系。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述测序接头用于与所述多核苷酸结合蛋白结合并且与分析物连接；所述多核苷酸结合蛋白用于控制所述分析物相对于跨膜孔的移动；所述连接体系用于使测序接头、多核苷酸结合蛋白和分析物在其中混合并且使所述测序接头与所述分析物连接以及使所述多核苷酸结合蛋白保持结合到所述测序接头上。
15.根据权利要求1至8和10-11中任一项所述的方法或根据权利要求12-14中任一项所述的试剂盒或权利要求9所述构建体在制备表征分析物的产品或表征分析物中的应用。
