本发明涉及基因工程，具体涉及一种ttr基因人源化小鼠模型构建的方法和应用。
背景技术：
1、实验动物是生命科学研究领域重要的实验工具之一，为生命科学研究不断提供新模型、新技术和新方法。常见的实验动物品种有小鼠、大鼠、兔、犬、鸡、猴、猪等。然而在医学实验中，由于实验动物与人存在遗传背景、生理特性和免疫反应上的差异，许多药物研发、抗体研发以及肿瘤精准治疗的动物实验结果并不能很好表现真正的人体反应。
2、随着现代基因工程技术的快速发展，将来自于人体的基因、细胞或组织针对性的导入到实验动物体内，建立的人源化动物模型有着与人体更为接近的生理病理特性，在生物医药领域有着广泛的应用价值。其中基因人源化动物模型是将人体的基因插入或代替至动物体基因中，进而产生人体基因嵌合动物模型。基因人源化动物模型能够表达部分人类蛋白以及模拟人体内细胞信号传导，可作为非灵长类动物的替代动物模型，在人源化抗体制备、抗体药物评价、人感染性疾病模型建立以及肿瘤精准医学研究中发挥重要作用。
3、转甲状腺素蛋白（transthyretin，ttr）也被称为维生素a结合蛋白，是人体的一种重要的血浆蛋白组成成分，广泛分布于多种细胞、血浆和组织液中。单体ttr是一种127个氨基酸的蛋白质，由人类18号染色体上的单个基因编码。功能性ttr蛋白是一种55-kda同源四聚体，主要在人体肝脏和大脑的脉络丛中合成，随后分泌到血液和脑脊液中，可作为甲状腺素的次要转运蛋白和血浆中视黄醇结合蛋白的主要载体。
4、生理环境下的ttr通常以中等稳定的四聚体形式循环，其单体解离率低。但ttr四聚体在病理情况或非正常生理状态下可发生分解，解离为单体。ttr的单体会生成种类复杂多样的淀粉样纤维，从而导致细胞内淀粉样纤维非正常生理性集聚。而细胞内的淀粉样异常沉积会造成细胞本身新陈代谢异常以至整个组织功能上的改变和紊乱，从而引发相关的疾病。
5、ttr基因突变可导致遗传性淀粉样变性病，如attr-cm和attr-pn。attr-cm即甲状腺素运载蛋白淀粉样变性心肌病，是由于ttr基因突变引起的ttr蛋白异常解离后聚合形成淀粉样物质沉积于心脏，表现为限制性心肌病和进行性心力衰竭。attr-pn是一种罕见致死性神经退行性疾病，是由于ttr基因变异导致周围神经和多器官系统受到影响的常染色体显性遗传性疾病。除了遗传性家族样病变，由研究表明，ttr可以调节内皮细胞的血管生成，促进损伤后神经再生，并通过抑制淀粉样蛋白-β肽（aβ）原纤维形成和隔离/清除 aβ 聚集体来预防阿尔茨海默症（alzheimer’s disease，ad）的进程，因此当ttr表达上升时，ad症状发展较慢。而另有报道显示，ttr遗传突变或是ad的风险基因。
6、此外，多项研究表明，ttr在多种肿瘤患者血液和肿瘤细胞内的表达存在异常，包括肝癌、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌等。例如在肝癌细胞中，ttr基因存在缺失，在体外转染肝癌细胞后可抑制其生长。也有研究发现ttr在胰腺导管癌中的表达水平上调，并且ttr在卵巢癌及结直肠癌等其他肿瘤中的表达也存在差异性。提示ttr可能在不同肿瘤中起着双重作用。现在多数研究认为，作为肿瘤中异于正常表达的蛋白之一，ttr是一种敏感度和特异性均较好的新的肿瘤标志物，在临床应用中具有潜在的价值和广阔的空间。
7、目前已有多种研发上市的ttr靶向药物，主要为ttr抑制剂和ttr稳定剂，用于人ttr淀粉样变性病治疗。在针对靶向ttr药物研究中，合适的动物模型在药物的临床前期研究中极为重要。因此，为了进一步研究ttr相关疾病的特征以及临床前期药物试验的有效性，本发明提供一种建立ttr基因人源化构建小鼠模型的新方法，并得到ttr人源化小鼠模型，该方法在可在较短的时间内获得ttr纯合基因的人源化小鼠模型，在药物筛选、有效性验证及人源化小鼠模型改造上具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种构建ttr基因人源化小鼠模型的方法，并得到ttr人源化小鼠，该方法在可在较短的时间内获得ttr纯合基因的人源化小鼠模型，在药物筛选、有效性验证及人源化小鼠模型改造上具有广阔的应用前景。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一个方面，本发明提供了一种用于切除小鼠ttr基因的sgrna序列，所述sgrna序列为如下核苷酸序列中的任一种：
4、（1）ttr-sgrna-3arm-3靶序列如seq id no：1所示；
5、（2）ttr-sgrna-3arm-4靶序列如seq id no：2所示；
6、（3）ttr-sgrna-3arm-5靶序列如seq id no：3所示；
7、（4）ttr-sgrna-5arm-4靶序列如seq id no：4所示；
8、（5）ttr-sgrna-5arm-5靶序列如seq id no：5所示；
9、（6）ttr-sgrna-5arm-6靶序列如seq id no：6所示；
10、（7）ttr-sgrna-5arm-7靶序列如seq id no：7所示。
11、第二个方面，本发明提供了一种用于切除小鼠ttr基因的sgrna表达载体，所述载体
12、含有能合成如上所述的sgrna序列的上下游引物，所述引物序列为如下所示的任一种：
13、合成sgrna-3arm-3的正向寡核苷酸序列如seq id no：8所示；
14、合成sgrna-3arm-3的反向寡核苷酸序列如seq id no：9所示；
15、合成sgrna-3arm-4的正向寡核苷酸序列如seq id no：10所示；
16、合成sgrna-3arm-4的反向寡核苷酸序列如seq id no：11所示；
17、合成sgrna-3arm-5的正向寡核苷酸序列如seq id no：12所示；
18、合成sgrna-3arm-5的反向寡核苷酸序列如seq id no：13所示；
19、合成sgrna-5arm-4的正向寡核苷酸序列如seq id no：14所示；
20、合成sgrna-5arm-4的反向寡核苷酸序列如seq id no：15所示；
21、合成sgrna-5arm-5的正向寡核苷酸序列如seq id no：16所示；
22、合成sgrna-5arm-5的反向寡核苷酸序列如seq id no：17所示；
23、合成sgrna-5arm-6的正向寡核苷酸序列如seq id no：18所示；
24、合成sgrna-5arm-6的反向寡核苷酸序列如seq id no：19所示；
25、合成sgrna-5arm-7的正向寡核苷酸序列如seq id no：20所示；
26、合成sgrna-5arm-7的反向寡核苷酸序列如seq id no：21所示。
27、进一步地，所述sgrna载体，
28、所述序列seq id no：8与seq id no：9用于反转录sgrna-3arm-3：
29、所述序列seq id no：10与seq id no：11用于反转录sgrna-3arm-4：
30、所述序列seq id no：12与seq id no：13用于反转录sgrna-3arm-5：
31、所述序列seq id no：14与seq id no：15用于反转录sgrna-5arm-4：
32、所述序列seq id no：16与seq id no：17用于反转录sgrna-5arm-5：
33、所述序列seq id no：18与seq id no：19用于反转录sgrna-5arm-6：
34、所述序列seq id no：20与seq id no：21用于反转录sgrna-5arm-7。
35、第三个方面，本发明提供了一种用于替换小鼠ttr基因的打靶载体，所述打靶载体及其核苷酸序列为如下所示的任一种：
36、i：11203-donor-2026promotor-v50mttr-loxp-pgk-puro-polya-loxp-use，其序列如seq id no：33所示；
37、ii：11203-donor-2026promotor-v50mttr-loxp-pgk-gfp-polya-loxp，其序列如seq id no：34所示；
38、iii：11203-donor-2026promotor-v50mttr-loxp-pgk-gfp-polya-loxp-h272-enhancer，其序列如seq id no：55所示；
39、iv：11203-donor-2026promotor-v50mttr-loxp-pgk-puro-polya-loxp-h272-enhancer，其序列如seq id no：56所示。
40、第四个方面，本发明提供了一种ttr基因人源化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
41、（1）确定切除小鼠ttr基因的sgrna序列，所述sgrna序列包括如上所述的sgrna序列，其序列如seq id no：1~7所示；
42、（2）将所述sgrna序列退火引物与线性化的质粒连接，获得切割载体，所述退火引物包括如seq id no：8~21所示的序列；
43、（3）制备打靶载体，所述打靶载体包括序列分别如seq id no：33、seq id no：34、seq id no：55、seq id no：56所述的序列；
44、（4）将切割载体与打靶载体共转化进小鼠胚胎干细胞，获得人源化httr小鼠胚胎干细胞；
45、（5）删除打靶载体中的抗性筛选标签基因片段；
46、（6）聚集人源化httr小鼠胚胎干细胞与小鼠胚胎，形成嵌合体胚胎；
47、（7）将所述嵌合体胚胎移植到假孕鼠子宫进行培育，获得新生代小鼠，即得人源化httr基因改造小鼠。
48、进一步地，还包括所述打靶载体的构建方法，所述打靶载体的构建方法为下述方法中的任一种：
49、方法一：
50、（1）将httr基因从起始密码子atg上游到终止密码子tga之间的全长dna序列插入到鼠mttr基因的atg之后；
51、（2）在httr基因的exon2引入c. 148g>a(p.v50m)点突变；
52、（3）在httr基因的终止密码子后插入抗性基因表达盒或egfp荧光基因表达盒：
53、（4）在进行mttr-httr编辑后小鼠基因组删除两个loxp位点之间的序列，留一个loxp位点；
54、（5）获得序列如seq id no：33或seq id no：34所示的打靶载体；
55、方法二：
56、（1）将httr基因从起始密码子atg上游到终止密码子tga之间的全长dna序列插入到鼠mttr的atg；
57、（2）在httr基因的exon2引入c. 148g>a(p.v50m)点突变；
58、（3）在httr基因的终止密码子后插入抗性基因表达盒或egfp荧光基因表达盒：
59、（4）在进行mttr-httr编辑后小鼠基因组删除两个loxp位点之间的序列，留一个loxp位点；
60、（5）获得序列如seq id no：33或seq id no：34所示的打靶载体；
61、（6）酶切序列如seq id no：33或seq id no：34所示的打靶载体，回收大片段作为骨架；以小鼠基因组dna为模板，扩增re element序列；以人基因组dna为模板，扩增h-pro序列；将骨架和re element片段、h-pro片段进行同源重组，获得序列如seq id no：55或seqid no：56所示的打靶载体。
62、进一步地，所述抗性基因表达盒序列如seq id no：30所示；所述egfp荧光基因表达盒序列如seq id no：31所示；所述loxp序列如seq id no：32所示。
63、进一步地，还包括扩增5arm的引物、扩增人源ttr的引物、扩增人源ttr_v50m的引物、扩增3arm的引物、5-ki鉴定引物、3-ki鉴定引物、抗性基因删除鉴定引物、扩增httr的引物、扩增mttr的引物；所述引物序列如下：
64、扩增5arm上游引物序列如seq id no：35所示；
65、扩增5arm下游引物序列如seq id no：36所示；
66、扩增人源ttr上游引物f1序列如seq id no：37所示；
67、扩增人源ttr_v50m-下游引物r1序列如seq id no：38所示；
68、扩增人源ttr_v50m-上游引物f2序列如seq id no：39所示；
69、扩增人源ttr下游引物r2序列如seq id no：40所示；
70、扩增3arm上游引物序列如seq id no：41所示；
71、扩增3arm下游引物序列如seq id no：42所示；
72、5-ki鉴定上游引物5arm-ttr-1f序列如seq id no:43所示；
73、5-ki鉴定下游引物3arm-ttr-1r序列如seq id no:44所示；
74、3-ki鉴定上游引物 ttr-puro-ko-f3序列如seq id no:45所示；
75、3-ki鉴定下游引物 ttr-3arm ki-4-right序列如seq id no:46所示；
76、抗性基因删除鉴定引物ttr-puro-ko-f3序列如seq id no:47所示；
77、抗性基因删除鉴定引物ttr-puro-ko-r3序列如seq id no:48所示；
78、扩增httr的上游引物 qf序列如seq id no:49所示；
79、扩增httr 的上游引物qr序列如seq id no:50所示；
80、扩增mttr的上游引物q-f1序列如seq id no:51所示；
81、扩增mttr的上游引物q-r1序列如seq id no:52所示。
82、进一步地，所述用于同源重组得到片段包括rm-element序列、扩增rm-element序列引物、扩增h-pro序列引物；
83、所述rm-element序列序列如seq id no:54所示；
84、所述扩增rm-element序列上游引物序列如seq id no:57所示；
85、所述扩增rm-element序列下游引物序列如seq id no:58所示；
86、所述扩增h-pro序列上游引物序列如seq id no:59所示；
87、所述扩增h-pro序列下游引物序列如seq id no:60所示。
88、第五个方面，本发明提供所述的sgrna序列，所述的sgrna表达载体、所述的打靶载体在制备构建ttr基因人源化小鼠模型中的应用。
89、本发明的有益效果在于：本发明提供一种建立ttr基因人源化构建小鼠模型的新方法，并得到ttr人源化小鼠模型，该方法在可在较短的时间内获得ttr纯合基因的人源化小鼠模型，在药物筛选、有效性验证及人源化小鼠模型改造上具有广阔的应用前景。
1.一种用于切除小鼠ttr基因的sgrna序列，其特征在于，所述sgrna序列为如下核苷酸序列中的任一种：
2.一种用于切除小鼠ttr基因的sgrna表达载体，其特征在于，所述载体
3.如权利要求2所述的用于切除小鼠ttr基因的sgrna表达载体，其特征在于，
4.一种用于替换小鼠ttr基因的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体及其核苷酸序列为如下所示的任一种：
5.一种ttr基因人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括所述打靶载体的构建方法，所述打靶载体的构建方法为下述方法中的任一种：
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述方法一或方法二中步骤（3）的抗性基因表达盒序列如seq id no：30所示；所述方法一或方法二中步骤（3）的egfp荧光基因表达盒序列如seq id no：31所示；所述方法一或方法二中步骤（4）的loxp序列如seq id no：32所示。
8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，还包括扩增5arm的引物、扩增人源ttr的引物、扩增人源ttr_v50m的引物、扩增3arm的引物、5-ki鉴定引物、3-ki鉴定引物、抗性基因删除鉴定引物、扩增httr的引物、扩增mttr的引物；所述引物序列如下：
9.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述用于同源重组得到片段包括rm-element序列、扩增rm-element序列引物、扩增h-pro序列引物；
10.如权利要求1所述的sgrna序列，如权利要求2或3所述的sgrna表达载体、如权利要求4所述的打靶载体在制备构建ttr基因人源化小鼠模型中的应用。
