本发明涉及生物医疗，具体涉及通过一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的代谢物组合及其应用。
背景技术：
1、胆道闭锁（biliary atresia, ba），新生儿期发生的进行性、特发性肝外胆管系统疾病，是一种破坏性的新生儿胆管炎症纤维阻塞，影响着不同长度的肝内和肝外胆管，是新生儿阻塞性黄疸最主要的原因，也是小儿肝移植最主要的原因。
2、肝门空肠吻合术（kasai根治术）是胆道闭锁的首选治疗方案。手术时间对于kasai手术的疗效有很大影响。研究发现，在出生后30或45天内进行kasai手术，其术后黄疸消失率和五年的自体肝生存率显著升高，对肝移植的需求显著降低。但不幸的是目前胆道闭锁不能及时诊断，一般手术的时间都到了出生后2个月后。
3、现有的胆道闭锁筛查和诊断血清学指标包括：①血清总胆红素，直接胆红素；其作为最初筛查指标。新生儿血清总胆红素>2.0 mg/dl（42–51 μmol/l），或直接胆红素>1.0mg/dl（17 μmol/l）需进行胆道闭锁排查，但对于诊断胆道闭锁特异性差；②ggt：大样本调查研究表明，不同年龄组中，胆道闭锁组ggt含量均明显高于其他胆汁淤积疾病组[chen x等. γ-gt与年龄结合诊断胆道闭锁的价值。儿科胃肠病学与营养学，2016, 63(3): 370-373]。liu等人[γ-gt对早期诊断胆道闭锁的价值。中华医学杂志，1998 ,61(12):716-720]报道ggt>300 u/l时，其诊断胆道闭锁的精确度为60％-85％诊断。ggt是胆道闭锁最常用的筛查指标，但临床病例中不同患儿之间差异较大，准确性受到局限；③其他指标：血清胆酸、凝血酶原浓度、血小板测定影响因素较多。影像学检查中，异常胆囊（胆囊缩小，收缩差）和肝门部纤维块是超声检查胆道闭锁患儿肝脏的特征性表现[tan等. 利用肝门纤维块及胆囊长度诊断胆道闭锁。儿科影像学，2000, 30(2): 69-73]，但肝门部纤维块不一定在每个患儿中均出现，并且超声检查因不同医生、机器等观察结果差异较大。因此文献中报道诊断胆道闭锁的敏感性与特异性各不相同。近期，有meta分析报道，胆囊闭锁和肝门部纤维块的特异性均可达到99％，然而相对应的敏感性为28％和80％[liu等. γ-gt对早期诊断胆道闭锁的价值. 中华医学杂志，1998, 61(12): 716-720]。其它检查虽然可以给胆道闭锁的诊断提供一些线索，但受到不同程度的限制。如十二指肠肠液检测操作困难；放射性核素检查可不同程度加重患儿梗阻性黄疸[el-guindi等. 设计与验证一个胆道闭锁诊断评分系统. 小儿肝病学杂志，2014, 61(1): 116-123]；3个月龄以内的婴儿胆管直径小、胆管内液体少，磁共振胰胆管成像检查诊断胆道闭锁的高假阳性率不可避免。此外，胆道闭锁的病理特征为小胆管增生、胆栓形成、毛细胆管和肝细胞胆汁淤积、汇管区或小叶周围纤维化，早期尚可见肝小叶结构。因此，临床应用于鉴别胆道闭锁与其他新生儿胆汁淤积症时，因检测准确性低或过程复杂导致胆道闭锁诊断和治疗的延迟。疾病早期，ba的临床表现、生物化学指标、影像学和组织学特征与其它胆汁淤积疾病存在重叠性，鉴别诊断过程曲折、复杂，容易导致诊断延迟。因此探索简单、特异性诊断方法从未停止。
4、由于缺乏有效的诊断标记物，患儿通常需要经过长时间的复杂诊断才能确诊，延误了最佳手术时间。中国专利文献cn101221129b公开了磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒，适用于肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。中国专利文献cn113533596a公开了新生儿胆道闭锁早期筛查标志物谷氨酸、牛磺酸、牛磺胆酸、吲哚乙酸、α-酮异戊酸、酮亮氨酸、2-羟基戊二酸和甘胆酸，适用于肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。该专利表明8指标联合模型的auc达到0.945，其灵敏度为91％，特异性为90.5％，这对于筛查产品而言，特异性偏低，容易产生大量假阳性，难以在临床使用。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中缺乏高特异性、高效、稳定的筛查新生儿胆道闭锁的代谢物的技术问题，本发明提供一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的代谢物及其应用。
2、所述“风险”指新生儿是否患有“胆道闭锁”；通过本发明方法对其风险进行评估的输出是与预先设定的标准值（即cutoff值，最佳评估阈值）相比较而得出的“有”或“无”的定性表述。
3、本发明发现，干血斑中的4个代谢物（猪胆酸、焦谷氨酸、α-氨基丁酸、3-甲基-2-氧代戊酸）结合单结合胆红素可用于胆道闭锁的出生筛查和早期诊断，以提早确诊和手术时间，最大程度改善预后。
4、本发明提供用于筛查胆道闭锁的代谢物组合、及其在制备胆道闭锁筛查产品中的用途、试剂盒和计算机系统，在胆道闭锁出生筛查方面具有灵敏度高、特异性高和/或检测通量高等优点。
5、为实现上述发明目的，本发明特提供以下技术方案：
6、本发明第一方面公开了一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的代谢物组合，所述代谢物组合包括以下一种或多种：猪胆酸、焦谷氨酸、α-氨基丁酸、3-甲基-2-氧代戊酸和单结合胆红素，且所述代谢物组合不只含单结合胆红素一种代谢物。
7、在一些实施方式中，所述代谢物组合由猪胆酸、焦谷氨酸、α-氨基丁酸、3-甲基-2-氧代戊酸和单结合胆红素组成。
8、在一些实施方式中，所述代谢物组合来自新生儿的生物样本，所述生物样本为全血、血浆、血清和干血斑。
9、在一些优选实施方式中，所述生物样本为干血斑。
10、本发明第二方面公开了一种用于检测如本发明第一方面所述的代谢物组合的试剂，所述试剂用于检测所述代谢物组合的浓度；所述浓度通过对新生儿的生物样本进行处理后，以液相色谱-质谱联用（lc-ms/ms）方法对生物样本中的代谢物组合进行定量检测得到。
11、在一些实施方式中，所述试剂为检测所述代谢物组合浓度的高效液相色谱试剂；所述对新生儿的生物样本进行处理为使用样本萃取液将生物样本中的代谢物萃取出来以作为检测样本，所述检测样本为生物样本的有机溶剂分散体系，所述生物样本为全血、血浆、血清或干血斑。
12、在一些实施方式中，所述有机溶剂分散体系的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇或乙腈；所述生物样本为干血斑。
13、在一些具体实施方式中，所述液相色谱为高效液相色谱（hplc）、超高效液相色谱（uplc）或纳升液相色谱（nano-lc），所述串联质谱为四级杆质谱（quadrupole, q）、飞行时间质谱（time of flight, tof）、离子肼质谱（ion trap）或高分辨轨道肼质谱（orbitrap）。
14、在一些具体实施方式中，所述液相色谱的分离条件包括：流动相a为含添加剂的水溶液，添加剂选自甲酸铵、乙酸铵、甲酸和乙酸中任一种或几种的组合，流动相b选自异丙醇、甲醇、乙腈、乙醇和丙二醇中一种或几种的组合；色谱柱选自t3、c8或c18硅胶填料柱，柱温设置为25-45℃，流速为0.2-0.6 ml/min；所述质谱的检测条件包括：采用三重四级杆质谱多反应监测（mrm）模式进行数据采集，选择代谢物的特征离子对信息，并采用标准品进行信息确认和检测方法建立，同时采用内标准品进行定量校正，得到生物样本中各代谢物的精准浓度值及相关比例值。作为示例性的具体的实施方式，所述液相色谱的分离条件可包括：进样5 μl，流动相a为5 mmol甲酸水溶液，流动相b为10%异丙醇+10%甲醇+80%乙腈，色谱柱为100毫米的hss t3柱，柱温设置为40℃，流速为0.3 ml/min，0-1.0 min维持4%的b，1.0-3.0 min从4%的b线性变化至50%的b，3.0-6.0 min从50%的b线性变化至80%的b，6.0-6.5min从80%的b线性变化至100%的b，6.5-8.0 min维持100%的b，8.0-9.0 min从100%的b线性变化至4%的b。
15、在一些具体的实施方式中，所述质谱选自四级杆质谱、飞行时间质谱、离子肼质谱和高分辨轨道肼质谱；所述质谱的条件和设定质谱定性定量检测模式包括：选择电喷离子源（esi），根据检测目标化合物的响应选择离子扫描模式；采用三重四级杆质谱多反应监测（mrm）模式进行数据采集，选择代谢物的特征离子对信息，并采用标准品进行信息确认和检测方法建立，同时采用内标准品进行定量校正，得到生物样本中各代谢物的精准浓度值及相关比例值。
16、本发明第三方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含如本发明第一方面所述的代谢物组合和/或如本发明第二方面所述的试剂。
17、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括提取代谢物的试剂。
18、在一些实施方式中，所述提取代谢物的试剂为有机溶剂和水的混合物。
19、在一些实施方式中，所述有机溶剂选自以下一种或多种：异丙醇、甲醇和乙腈。
20、在一些实施方式中，所述试剂盒包括同位素内标。同位素内标是指稳定同位素标记的代谢物，所述同位素内标例如为氘代。
21、本发明第四方面公开了如本发明第一方面所述的代谢物组合、如本发明第二方面所述的试剂或如本发明第三方面所述的试剂盒在制备评估新生儿是否患有胆道闭锁的产品中的应用；
22、所述应用为猪胆酸和/或检测猪胆酸的试剂在制备评估新生儿是否患有胆道闭锁的试剂盒中的应用；和/或，
23、所述应用为焦谷氨酸和/或检测焦谷氨酸的试剂在制备评估新生儿是否患有胆道闭锁的试剂盒中的应用；和/或，
24、所述应用为α-氨基丁酸和/或检测α-氨基丁酸的试剂在制备评估新生儿是否患有胆道闭锁的试剂盒中的应用；和/或，
25、所述应用为3-甲基-2-氧代戊酸和/或检测3-甲基-2-氧代戊酸的试剂在制备评估新生儿是否患有胆道闭锁的试剂盒中的应用。
26、本发明第五方面提供了一种计算机辅助的用于评估新生儿胆道闭锁风险的方法，所述方法包括以下步骤：
27、步骤1：接收或输入新生儿生物样本中的代谢物组合的浓度信息，所述代谢物组合为本发明第一方面所述的代谢物组合；
28、步骤2：将步骤1接收或输入的代谢物组合的浓度输入公式1，输出对所述生物样本来源的受新生儿是否患有胆道闭锁的评估结果；
29、所述公式1为：p=c1*0.448+c2*0.834+c3*0.7-c4*879+c5*69.6-84.9；其中，所述c1为生物样本中焦谷氨酸按μm的浓度单位表示时的浓度值，c2为生物样本中3-甲基-2-氧代戊酸按μm的浓度单位表示时的浓度值，c3为生物样本中α-氨基丁酸按μm的浓度单位表示时的浓度值，c4为生物样本中猪胆酸按μm的浓度单位表示时的浓度值，c5为生物样本中单结合胆红素按μm的浓度单位表示时的浓度值；
30、所述评估结果的判断标准为：当p≥最佳评估阈值时，输出的评估结果为“所述新生儿患有胆道闭锁”；当p＜最佳评估阈值时，输出的评估结果为“所述新生儿不患有胆道闭锁”；所述最佳评估阈值为cutoff值，最佳评估阈值优选为0。
31、所述“风险”指新生儿是否患有“胆道闭锁”。
32、本发明第六方面公开了一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的系统，其中，所述系统包括：
33、（1）信息获取模块，用于接收或输入新生儿生物样本中的代谢物组合的浓度信息，所述代谢物组合为本发明第一方面所述的代谢物组合。
34、（2）胆道闭锁疾病风险评估模块，用于根据所述代谢物组合的浓度评估所述新生儿是否患有胆道闭锁；所述评估通过将信息获取模块接收或输入的代谢物组合的浓度输入公式1后输出的对所述生物样本来源的新生儿是否患有胆道闭锁的评估结果来实现；
35、所述公式1为：p=c1*0.448+c2*0.834+c3*0.7-c4*879+c5*69.6-84.9；其中，所述c1为生物样本中焦谷氨酸按μm的浓度单位表示时所取的浓度值，c2为生物样本中3-甲基-2-氧代戊酸按μm的浓度单位表示时所取的浓度值，c3为生物样本中α-氨基丁酸按μm的浓度单位表示时所取的浓度值，c4为生物样本中猪胆酸按μm的浓度单位表示时所取的浓度值，c5为生物样本中单结合胆红素按μm的浓度单位表示时所取的浓度值；
36、所述评估结果的判断标准为：当p≥最佳评估阈值时，输出的评估结果为“所述新生儿患有胆道闭锁”；当p＜最佳评估阈值时，输出的评估结果为“所述新生儿不患有胆道闭锁”；所述最佳评估阈值为cutoff值，最佳评估阈值优选为0。
37、在一些实施方式中，所述系统还包括以下一个或多个模块：
38、（3）样品前处理模块，用于沉淀蛋白提取检测样本中目标代谢物；所述检测样本为生物样本的有机溶剂分散体系，所述有机溶剂分散体系的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇或乙腈。
39、（4）样品检测模块，用于检测样品中所述代谢物组合的浓度水平。
40、在一些具体实施方式中，所述样品检测模块至少用于执行检测代谢物的液相色谱串联质谱联用（lc-ms/ms）操作；所述液相色谱为高效液相色谱（hplc）、超高效液相色谱（uplc）或纳升液相色谱（nano-lc），所述串联质谱为四级杆质谱（quadrupole, q）、飞行时间质谱（time of flight, tof）、离子肼质谱（ion trap）或高分辨轨道肼质谱（orbitrap）；所述液相色谱的分离条件包括：流动相a为5 mmol甲酸铵-甲酸水溶液，流动相b为10%异丙醇+10%甲醇+80%乙腈，色谱柱为100毫米的hss t3柱，柱温设置为40℃，流速为0.3 ml/min，0-1.0 min维持4%的b，1.0-3.0 min从4%的b线性变化至50%的b，3.0-6.0 min从50%的b线性变化至80%的b，6.0-6.5 min从80%的b线性变化至100%的b，6.5-8.0 min维持100%的b，8.0-9.0 min从100%的b线性变化至4%的b；所述质谱的检测条件包括：采用三重四级杆质谱多反应监测（mrm）模式进行数据采集，选择代谢物的特征离子对信息，并采用标准品进行信息确认和检测方法建立，同时采用内标准品进行定量校正，得到生物样本中各代谢物的精准浓度值及相关比例值。
41、在一些具体实施方式中，所述样品前处理模块，所述样品前处理模块至少用于执行沉淀蛋白和代谢物组提取的操作；所述操作包括对所述生物样本用异丙醇：甲醇（v/v）=1：1-1：5进行提取，离心后取上清液用于检测。
42、本发明第七方面公开了一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，其中，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如本发明第六方面所述的系统的功能，或实现如本发明第五方面所述方法的步骤。
43、本发明第八方面公开了一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，其中，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如本发明第六方面所述系统的功能，或实现如本发明第五方面所述方法的步骤。
44、本发明有益的技术效果：
45、本发明提出的代谢物组合可用于准确评估新生儿胆道闭锁风险，能够实现临床上新生儿胆道闭锁早期筛查。在临床使用时，通过定量测定新生儿血液样本中的代谢物组合的含量，可快速筛查具有胆道闭锁高风险的新生儿。基于本发明公开的5种重要的胆道闭锁差异代谢物建立的评估模型在评估新生儿患有胆道闭锁的风险时具有灵敏度和特异性高、准确性好的优点。
1.一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的代谢物组合，其特征在于，所述代谢物组合包括以下一种或多种：猪胆酸、焦谷氨酸、α-氨基丁酸、3-甲基-2-氧代戊酸和单结合胆红素，且所述代谢物组合不只含单结合胆红素一种代谢物。
2.如权利要求1所述的代谢物组合，其特征在于，所述代谢物组合来自新生儿的生物样本，所述生物样本为全血、血浆、血清或干血斑；和/或，所述代谢物组合由猪胆酸、焦谷氨酸、α-氨基丁酸、3-甲基-2-氧代戊酸和单结合胆红素组成。
3.如权利要求2所述的代谢物组合，其特征在于，所述生物样本为干血斑。
4.一种用于检测如权利要求1-3任一项所述的代谢物组合的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测所述代谢物组合的浓度；所述浓度通过对新生儿的生物样本进行处理后，以液相色谱-质谱联用方法对生物样本中的代谢物组合进行定量检测得到。
5.如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂为检测所述代谢物组合浓度的高效液相色谱试剂；所述对新生儿的生物样本进行处理为使用样本萃取液将生物样本中的代谢物萃取出来以作为检测样本，所述检测样本为生物样本的有机溶剂分散体系，所述生物样本为全血、血浆、血清或干血斑。
6.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述有机溶剂分散体系的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇或乙腈；所述生物样本为干血斑。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任一项所述的代谢物组合和/或如权利要求4-6中任一项所述的试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括提取代谢物的试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述提取代谢物的试剂为有机溶剂和水的混合物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述有机溶剂选自以下一种或多种：异丙醇、甲醇和乙腈。
11.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括同位素内标。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述同位素内标为氘代。
13.如权利要求1-3中任一项所述的代谢物组合、如权利要求4-6中任一项所述的试剂或如权利要求7-12中任一项所述的试剂盒在制备评估新生儿是否患有胆道闭锁的产品中的应用。
14.一种计算机辅助的用于评估新生儿胆道闭锁风险的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述最佳评估阈值为0。
16.一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的系统，其特征在于，所述系统包括：
17.如权利要求16所述的系统，其特征在于，所述最佳评估阈值为0。
18.如权利要求17所述的系统，其特征在于，所述系统还包括以下一个或多个模块：
19.一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如权利要求16-18中任一项所述系统的功能，或实现如权利要求14或15所述方法的步骤。
20.一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，其特征在于，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如权利要求16-18中任一项所述系统的功能，或实现如权利要求14或15所述方法的步骤。
