本文描述了用于识别、标注及分析生物分子的方法及组成物。具体描述了适用于光活化及标注生物分子亚群的可裂解探针。所述方法及组成物可能特别适用于分析生物样品，例如识别细胞或组织样品中的近端生物分子。
背景技术：
1、细胞由不同类型的生物分子(biological molecule/biomolecule)构成。细胞中的生物分子与亚细胞环境中的相邻生物分子相互作用，形成复合物、细胞器或其他组装体，且执行各种基本的细胞功能。表征生物分子在亚细胞环境中相互作用以及生物分子如何一起发挥作用极具挑战性。生物分子较小，且其存在于具有数千万个其他分子的细胞环境中。相邻生物分子之间的相互作用通常较弱，且用于研究生物分子的技术会破坏其相互作用。虽然例如酵母双杂交分析及最近的邻近标记等技术提高了我们对细胞环境的理解，但这些技术受到各种限制，例如非特异性结合、反应时间慢及天然细胞环境的破坏，导致假阳性及错过相互作用。需要更好的工具来确定自然发生的生物分子相互作用。本文描述了更好地分析内源性生物分子相互作用的系统、组成物及方法。
技术实现思路
1、本文描述了更好地分析内源性生物分子相互作用的系统、组成物及方法。所述方法及组成物可适用于识别、标注及分析生物分子。具体描述了适用于光活化及标注生物分子亚群的可裂解探针。所述方法及组成物可特别适用于分析生物样品，例如识别细胞或组织样品中的近端生物分子。这些探针可特别适用于经由显微镜系统的选择性光照明对生物分子进行选择性标注及邻近标记。通常，在一个实施例中，光反应性及可裂解探针包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；双链结构中具可裂解位点，其中锚定链及探测链是用于裂解子的施加而在可裂解位点断裂；位于探针中的光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
2、此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。锚定链及探测链包括dna、rna或dna及rna的组合。锚定链比探测链长。锚定链及探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。双链结构的长度至少为10个核苷酸。双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。双链结构的解链温度tm为至少50℃。锚定链及探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。锚定链及探测链的长度不超过40个核苷酸，不超过50个核苷酸，或不超过60个核苷酸。锚定链及探测链的长度在15个核苷酸与40个核苷酸之间。锚定链可包括一级序列，且相对于可裂解位点，标签与诱饵附接位点位于一级序列的同一侧上。探针在诱饵附接位点处附接至诱饵分子。探针共价附接至诱饵分子。诱饵分子包括抗体、clip-标签、halotag、蛋白a、蛋白g、蛋白l、rna分子、小分子或snap-标签。诱饵分子包括抗体。诱饵分子包括二级抗体。标签包括生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。生物素衍生物包括以下的基团：
3、
4、可裂解位点包括核酸内切酶位点。可裂解位点包括限制酶位点。光活化弹头包括核碱基。光活化弹头包括胸腺嘧啶特异性弹头。光活化弹头包含核碱基特异性补骨脂素，包括的基团或核碱基特异性叠氮化物。光活化弹头包括核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(cnvk)，包括的基团。光活化弹头包括核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。如前述技术方案中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中光活化弹头包含核碱基特异性二氮丙啶，包括的基团。
5、通常，在一个实施例中，一种用于光活化标记的方法包括将上述光反应性及可裂解探针结合至生物样品中的生物分子，将诱饵分子结合至生物样品中的目标生物分子以交联探针及目标生物分子，递送光辐射以活化光活化弹头且将锚定链共价键合至探测链，裂解探针双链区域中的可裂解位点以自探针的其余部分移除一部分锚定链及探测链，且自生物样品移除经裂解及未结合的探针。
6、一般而言，在一个实施例中，一种分析方法包括将光反应性及可裂解探针递送至生物样品，所述探针包括核酸锚定链及核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构，选择性地照明生物样品的第一区域，从而活化位于探针中的光活化弹头且将探测链共价键合至第一区域中的锚定链，且不照明生物样品的第二区域，以使探测链及锚定链在第二区域中不共价键合，裂解第一及第二区域中的探针的双链区域中的可裂解位点以自探针的其余部分移除锚定链的经裂解部分及探测链的经裂解部分，将竞争核酸链递送至第一及第二区域，其中竞争核酸链是用以与探测链竞争结合至锚定链，且用竞争核酸链替代在第二区域中的探针的所述探测链中，但不替代在第一区域中的探针中的探测链，其中第一区域中的探测链与锚定链之间的共价键合，以防止竞争链替代第一区域中的探测链。
7、此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。探针可进一步包括结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。将可检测标记与标签结合且通过可检测标记的活性，可检测地邻近标记邻近于目标生物分子的相邻分子的步骤。可检测地邻近标记的步骤可包括光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度tm可为至少50℃。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度tm可为52℃至60℃。所述方法可进一步包括其中(i)裂解步骤后探针可包括双链结构，(ii)替代步骤后探针可包括双链结构，及(iii)裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度tm低于第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度tm。裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度tm为26℃至34℃。第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度tm为44℃至53℃。替代步骤可在高于裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度tm且低于替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度tm的温度下进行。锚定链的一级序列、探测链的一级序列和/或竞争链的一级序列与生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与探测链或锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。裂解可裂解位点的步骤可包括用限制性核酸内切酶和/或限制酶切割可裂解位点。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化核碱基弹头。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化胸腺嘧啶特异性弹头。选择性地照明生物样品的步骤可包括自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包括用可控相机对照明样品进行成像，用相机获取第一视野中的生物样品的亚细胞形态的至少一个影像，处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域，及获得所关注区域的坐标信息。自第一及第二区域移除经裂解及未结合的探针的步骤。选择性地照明的步骤可包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明区域。选择性地照明的步骤可包括以100mw至300mw的功率强度照明。可检测标记可包括催化标记。生物样品可包括至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。生物样品可包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。选择性地照明的步骤可包括照明由点扩散函数定义的区域。将生物样品置于显微镜载物台上，所述方法进一步包括自载物台移除生物样品的照明区域的至少一部分。对样品进行质谱分析或测序分析的步骤。标签可包括生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
8、一般而言，在一个实施例中，用于标记生物分子的试剂盒包括上述任一项所述的光反应性及可裂解探针于第一容器中，以及说明材料。
9、此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征中。竞争链，其中竞争链与锚定链互补。当竞争链及锚定链形成双链结构时，所述结构的解链温度tm为44℃至53℃。
10、通常，在一个实施例中，用于探针生成的试剂盒包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；可裂解位点位于双链结构中，其中锚定链及探测链是用于裂解子的施加而在可裂解位点断裂；光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
11、通常，在一个实施例中，光反应性探针包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；位于探针中的光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
12、此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。锚定链及探测链包括dna、rna或dna及rna的组合。锚定链比探测链长。锚定链及探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。双链结构的长度至少为10个核苷酸。双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。双链结构的解链温度tm为至少50℃。锚定链及探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。锚定链及探测链的长度不超过40个核苷酸，不超过50个核苷酸，或不超过60个核苷酸。锚定链及探测链中的长度分别在15个核苷酸与40个核苷酸之间。锚定链可包括一级序列，且相对于可裂解位点，标签与诱饵附接位点位于一级序列的同一侧上。探针在诱饵附接位点处附接至诱饵分子。探针共价附接至诱饵分子。诱饵分子可包括抗体、clip-标签、halotag、蛋白a、蛋白g、蛋白l、rna分子、小分子或snap-标签。诱饵分子可包括抗体。诱饵分子可包括二级抗体。
13、标签可包括生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。生物素衍生物包括以下的基团：
14、光活化弹头可包括核碱基。光活化弹头可包括胸腺嘧啶特异性弹头。光活化弹头可包括核碱基特异性补骨脂素，包括的基团。光活化弹头可包括核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(cnvk)，包括的基团。
15、光活化弹头可包括核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。
16、一般而言，在一个实施例中，一种用于光活化标记的方法包括将上述任何光反应性探针结合至生物样品中的生物分子，将诱饵分子结合至生物样品中的目标生物分子以交联探针及目标生物分子，将光辐射递送至生物样品的第一区域以活化光活化弹头且将锚定链共价键合至探测链，将探测链自探针的其余部分移除且使竞争链与生物样品的未用光辐射处理的第二区域中的锚定链杂交，及自生物样品移除经裂解及未结合的探针。
17、一般而言，在一个实施例中，一种分析方法包括将光反应性探针递送至生物样品，所述探针包括核酸锚定链及核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构，选择性地照明生物样品的第一区域，从而活化位于探针中的光活化弹头且将探测链共价键合至第一区域中的锚定链，且不照明生物样品的第二区域，以使探测链及锚定链在第二区域中不共价键合，在第二区域中将探测链自探针的其余部分解链，将竞争核酸链递送至第一及第二区域，其中竞争核酸链是用以与探测链竞争结合至锚定链，且用所述竞争核酸链替代在第二区域中的探针中所述探测链，但不替代第一区域中的探针中的所述探测链，其中第一区域中的探测链与锚定链之间的共价键合，以防止竞争链替代第一区域中的探测链。
18、此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。探针可进一步包括结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。将可检测标记与标签结合，且通过可检测标记的活性，可检测地邻近标记邻近于目标生物分子的相邻分子的步骤。可检测地邻近标记的步骤可包括光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度tm为至少50℃。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。所述方法可进一步包括其中(i)裂解步骤后探针可包括双链结构，(ii)替代步骤后探针可包括双链结构，及(iii)裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度tm低于第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度tm。裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度tm为26℃至34℃。第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度tm为44℃至53℃。替代步骤是在高于裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度tm且低于替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度tm的温度下进行。锚定链的一级序列、探测链的一级序列和/或竞争链的一级序列与生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与探测链或锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。
19、将探测链自第二区域中的探针的其余部分移除的步骤可包括用核酸外切酶消化探测链。将探测链自第二区域中的探针的其余部分移除的步骤可包括用解链因子处理样品。将探测链自第二区域中的探针的其余部分移除的步骤可包括用解链因子(包括解旋酶、小分子或升高的温度)处理样品。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化核碱基弹头。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化胸腺嘧啶特异性弹头。选择性地照明生物样品的步骤可包括自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包括用可控相机对照明样品进行成像，用相机获取第一视野中的生物样品的亚细胞形态的至少一个影像，处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域，及获得所关注区域的坐标信息。自第一及第二区域移除未结合的探针的步骤。选择性地照明的步骤可包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明区域。选择性地照明的步骤可包括以100mw至300mw的功率强度照明。可检测标记可包括催化标记。生物样品可包括至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。生物样品可包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。选择性地照明的步骤可包括照明由点扩散函数定义的区域。将生物样品置于显微镜载物台上，所述方法进一步包括自载物台移除生物样品的照明区域的至少一部分。对样品进行质谱分析或测序分析的步骤。标签可包括生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
20、通常，在一个实施例中，用于标记生物分子的试剂盒包括上述任一项所述的光反应性探针于第一容器中，以及说明材料。此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。竞争链，其中竞争链与锚定链互补。竞争链及锚定链形成双链结构，所述结构的解链温度tm为44℃至53℃。
21、通常，在一个实施例中，用于探针生成的试剂盒包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
1.一种光反应性及可裂解探针，其包含：
2.根据权利要求1所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链包含dna、rna或dna和rna的组合。
3.根据权利要求1或2所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。
4.根据权利要求1至2任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述双链结构的长度为至少10个核苷酸。
5.根据权利要求1至4任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。
6.根据权利要求1至4任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述双链结构的解链温度tm为至少50℃。
7.根据权利要求1至6任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。
8.根据权利要求1至7任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为不超过40个核苷酸、不超过50个核苷酸或不超过60个核苷酸。
9.根据权利要求1、2或4至6中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度分别在15个核苷酸至40个核苷酸之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链包含一级序列，且相对于所述可裂解位点，所述标签与所述诱饵附接位点位于所述一级序列的同一侧上。
11.根据权利要求1至12中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述探针在所述诱饵附接位点处附接至一诱饵分子。
12.根据权利要求11所述的光反应性及可裂解探针，其中所述探针共价附接至所述诱饵分子。
13.根据权利要求11或12所述的光反应性及可裂解探针，其中所述诱饵分子包含抗体、clip-标签、halotag、蛋白a、蛋白g、蛋白l、rna分子、小分子或snap-标签。
14.根据权利要求11或12所述的光反应性及可裂解探针，其中所述诱饵分子包含抗体。
15.根据权利要求11或12所述的光反应性及可裂解探针，其中诱饵分子包含二级抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述标签包含生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
17.根据权利要求16所述的光反应性及可裂解探针，其中所述生物素衍生物包括以下的基团：
18.根据权利要求1至17中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述标签包含生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述可裂解位点包含一限制酶位点。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一胸腺嘧啶特异性弹头。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性补骨脂素，包括的基团或一核碱基特异性叠氮化物。
23.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(cnvk)，包括的基团。
24.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。
25.根据以上任一项权利要求所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性二氮丙啶，包括的基团。
26.一种光活化标记的方法，其包含：
27.一种分析方法，其包含：
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述探针进一步包含结合至所述探测链的一标签，其中所述标签是用以结合至可检测标记。
29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包含将一可检测标记与所述标签结合，且通过可检测标记活性，可检测地邻近标记邻近目标生物分子的相邻分子。
30.根据权利要求29所述的方法，其中可检测地邻近标记包含光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中在裂解所述可裂解位点之前，所述双链结构的解链温度tm为至少50℃。
32.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中在裂解所述可裂解位点之前，所述双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中(i)所述探针在裂解步骤之后包含双链结构，(ii)所述探针在替代步骤之后包含双链结构，以及(iii)裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度tm低于所述第二区域中的替代步骤之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度tm。
34.根据权利要求33所述的方法，其中裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度tm为26℃至34℃。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述第二区域中的所述替换步骤之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度tm为44℃至53℃。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述替换步骤是在高于裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度tm且低于所述替换步骤之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度tm的温度下进行。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述锚定链的一级序列、所述探测链的一级序列和/或所述竞争核酸链的一级序列与所述生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与所述探测链或所述锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。
38.根据权利要求27至37中任一项所述的方法，其中裂解所述可裂解位点包含用一核酸内切酶和/或一限制酶切割所述可裂解位点。
39.根据权利要求27至38中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一核碱基弹头。
40.根据权利要求27至39中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一胸腺嘧啶特异性弹头。
41.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其中选择性地照明所述生物样品包含自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包含：
42.根据权利要求27至41中任一项所述的方法，其进一步包含自所述第一区域及所述第二区域移除经裂解及未结合的探针。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明一区域。
44.根据权利要求27至43中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以100mw至300mw的功率强度照明。
45.如权利要求29所述的方法，其中所述可检测标记包含一催化标记。
46.根据权利要求27至45中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。
47.根据权利要求27至45中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。
48.根据权利要求27至47中任一项所述的方法，其中选择性地照明包括照明由点扩散函数定义的一区域。
49.根据权利要求27至48中任一项所述的方法，其中所述生物样品是置于一显微镜载物台上，所述方法进一步包含自所述载物台移除所述生物样品的照明区域的至少一部分。
50.根据权利要求27至49中任一项所述的方法，其进一步包含对所述样品进行质谱分析或测序分析。
51.根据权利要求28至50中任一项所述的方法，其中所述标签包含生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
52.一种标记生物分子的试剂盒，其包含：
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其进一步包含竞争链，其中所述竞争链与锚定链互补。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中当所述竞争链及所述锚定链形成一双链结构时，所述结构的解链温度tm为44℃至53℃。
55.一种用于探针生成的试剂盒，其包含：
56.一种光反应性探针，其包含：
57.根据权利要求56所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链包含dna、rna或dna和rna的组合。
58.根据权利要求56或57所述的光反应性探针，其中所述锚定链比所述探测链长。
59.根据权利要求56或57所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的光反应性探针，其中所述双链结构的长度为至少10个核苷酸。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的光反应性探针，其中所述双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。
62.根据权利要求56至60中任一项所述的光反应性探针，其中所述双链结构的解链温度tm为至少50℃。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为不超过40个核苷酸、不超过50个核苷酸或不超过60个核苷酸。
65.根据权利要求56至62中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度分别在15个核苷酸与40个核苷酸之间。
66.根据权利要求56至65中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链包含一级序列，且相对于可裂解位点，所述标签与所述诱饵附接位点位于所述一级序列的同一侧上。
67.根据权利要求56至66中任一项所述的光反应性探针，其中所述探针在所述诱饵附接位点处附接至诱饵分子。
68.根据权利要求67所述的光反应性探针，其中所述探针共价附接至所述诱饵分子。
69.根据权利要求67或68所述的光反应性探针，其中所述诱饵分子包含抗体、clip-标签、halotag、蛋白a、蛋白g、蛋白l、rna分子、小分子或snap-标签。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的光反应性探针，其中所述诱饵分子包含抗体。
71.根据权利要求67至69中任一项所述的光反应性探针，其中诱饵分子包含二级抗体。
72.根据权利要求56至71中任一项所述的光反应性探针，其中所述标签包含生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
73.根据权利要求72所述的光反应性探针，其中所述生物素衍生物包括以下的基团：
74.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基。
75.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一胸腺嘧啶特异性弹头。
76.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性补骨脂素，包括的基团或一核碱基特异性叠氮化物。
77.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(cnvk)，包括的基团。
78.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。
79.一种光活化标记的方法，其包含：
80.一种分析方法，其包含：
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述探针进一步包含结合至所述探测链的一标签，其中所述标签是用以结合至可检测标记。
82.根据权利要求81所述的方法，其进一步包含将一可检测标记与所述标签结合，且通过可检测标记活性，可检测地邻近标记邻近目标生物分子的相邻分子。
83.根据权利要求82所述的方法，其中可检测地邻近标记包含光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中在裂解可裂解位点之前所述双链结构的解链温度tm为至少50℃。
85.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中在裂解可裂解位点之前所述双链结构的解链温度tm为52℃至60℃。
86.根据权利要求80至85中任一项所述的方法，其中(i)所述探针在裂解步骤之后包含双链结构，(ii)所述探针在替代步骤之后包含双链结构，以及(iii)裂解可裂解位点之后的所述第二区域中的所述双链结构的解链温度tm低于所述第二区域中的替代步骤之后的所述第二区域中的所述双链结构的解链温度tm。
87.根据权利要求86所述的方法，其中裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的所述双链结构的所述解链温度tm为26℃至34℃。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中所述第二区域中的所述替换步骤之后的所述第二区域中的所述双链结构的所述解链温度tm为44℃至53℃。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述替换步骤在高于裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的所述解链温度tm且低于所述替换步骤之后的所述第二区域中的双链结构的所述解链温度tm的温度下进行。
90.根据权利要求80至89中任一项所述的方法，其中所述锚定链的一级序列、所述探测链的一级序列和/或所述竞争核酸链的一级序列与所述生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与所述探测链或所述锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。
91.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其中将所述探测链自所述第二区域中的所述探针的其余部分移除，包含用一核酸外切酶消化所述探测链。
92.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其中将所述探测链自所述第二区域中的所述探针的其余部分移除，包含用一解链因子处理所述样品。
93.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其中将所述探测链自所述第二区域中的所述探针的其余部分移除包含使用包含一解旋酶、一小分子或升高的温度的解链因子处理所述样品。
94.根据权利要求80至91中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一核碱基弹头。
95.根据权利要求80至94中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一胸腺嘧啶特异性弹头。
96.根据权利要求82至95中任一项所述的方法，其中选择性地照明所述生物样品包含自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包含：
97.根据权利要求82至96中任一项所述的方法，其进一步包含自所述第一区域及所述第二区域移除未结合的探针。
98.根据权利要求82至97中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明一区域。
99.根据权利要求82至98中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以100mw至300mw的功率强度照明。
100.根据权利要求82所述的方法，其中所述可检测标记包含催化标记。
101.根据权利要求82至100中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。
102.根据权利要求82至100中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。
103.根据权利要求82至102中任一项所述的方法，其中选择性地照明包括照明由点扩散函数定义的一区域。
104.根据权利要求82至103中任一项所述的方法，其中所述生物样品是置于显微镜载物台上，所述方法进一步包含自所述载物台移除所述生物样品的照明区域的至少一部分。
105.根据权利要求82至104中任一项所述的方法，其进一步包含对所述样品进行质谱分析或测序分析。
106.根据权利要求83至105中任一项所述的方法，其中所述标签包含生物素衍生物、clip-标签、点击化学标签、地高辛、halotag、肽标签或snap-标签。
107.一种标记生物分子的试剂盒，其包含：
108.根据权利要求107所述的试剂盒，其进一步包含竞争链，其中所述竞争链与锚定链互补。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中当所述竞争链及所述锚定链形成一双链结构时，其中所述结构的解链温度tm为44℃至53℃。
110.一种用于探针生成的试剂盒，其包含：
