本发明属于蛋白质工程，尤其涉及一种具有三螺旋结构的重组ⅹⅶ型胶原蛋白及其应用。
背景技术：
1、xvii型胶原蛋白在体内含量极其微量，极难通过提取方式直接获得，且该方法成本高，故目前基本都用重组方式实现体外量产，涉及的常用的体外重组表达系统有大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2、天然胶原蛋白具有独特的三螺旋结构，与其稳定性及促细胞增殖、粘附、迁移等多种生物学活性密切相关（marion，2010年）。xvii型胶原蛋白全长1497个氨基酸，包含胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域，进一步划分为16个非三螺旋区和15个三螺旋区，交错排列，体外重组表达难度大，产量低、易降解，而需要组装成天然的非三螺旋与三螺旋交错的天然构象更为困难。
3、专利公开号cn110845603a选取c15螺旋区的截短序列及xvii型胶原蛋白c端接近130个氨基酸进行表达验证，具有较好的产量，采用大肠杆菌表达系统；专利公开号cn116640205a采用毕赤酵母表达系统，选取非螺旋区nc16、c15螺旋区的截短序列及xvii型胶原蛋白c端进行拼接组合；专利公开号cn116751282a采用酿酒酵母表达系统，c15螺旋区的截短序列及c1螺旋区进行拼接组合。但上述技术都未显示能够形成胶原蛋白天然的三螺旋结构。
4、在作为护肤品成分之一时，胶原蛋白天然的胶束结构和大分子量特性，使其不易透过皮肤屏障到达真皮层发挥作用。
5、综上，现有技术存在以下问题：1）未形成高级的三螺旋构象；2）生物活性低；3）热稳定性差；4）天然全长胶原蛋白分子量大，不易透皮等。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种具有三螺旋结构的重组ⅹⅶ型胶原蛋白，本发明提供的重组胶原蛋白纯度高、热稳定性好、生物活性高，且分子量显著小于天然全长的胶原蛋白，实验表明具有促细胞迁移等多种生物活性。
2、本发明所述一种重组ⅹⅶ型胶原蛋白，其氨基酸序列包含n个核心单元，其中n是1或大于1的整数，所述核心单元的氨基酸序列如seq id no：1所示。
3、优选地，所述n选自1、2、3中的任一个数值。最优选地，所述n选自3。
4、所述的n个核心单元进行重复串联，可以是核心单元头尾相串联，还可以是由连接子（linker）将核心单元串联起来，所述linker优选含有甘氨酸（gly）和/或丝氨酸（ser），所述linker优选含有1-5个氨基酸。
5、进一步地，本发明所述核心单元串联形成的氨基酸序列，其头部和尾部还可以拼接多个氨基酸，优选为1和2个氨基酸。
6、优选地，本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
7、本发明提供了编码所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的基因。
8、所述编码包括由dna分子转录形成rna产物，随后翻译所产生的蛋白；或由dna分子转录以提供rna产物，经加工以提供加工的rna产物，随后翻译而产生的蛋白。
9、优选地，编码本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白的核苷酸序列如seq id no：3所示。
10、本发明提供了表达所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的重组载体，包括所述的基因。
11、载体包括衍生自任何来源并且能够基因组整合或自主复制的任何核酸分子（例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状单链或双链dna或rna核酸分子），其包含已可操作连接的一种或更多种核酸分子的核酸分子。载体可以包括，例如一个或多个可选择的标记物、一个或多个复制起点（例如原核和真核起点）、至少一个多克隆位点、和/或促进构建体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件。优选的，所述载体包括但不限于pet28a、pcdfduet-1、ppiczαa和ppic9k。
12、在本发明中，载体可以单独克隆有所述重组人iii型胶原蛋白基因，也可以在同一载体上克隆有脯氨酸羟化酶基因和/或赖氨酸羟化酶基因与重组人iii型胶原蛋白基因。
13、本发明提供了表达所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的重组细胞，所述重组细胞中转染有所述的重组载体。
14、所述重组细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母。
15、本发明的第二目的是提供所述重组ⅹⅶ型胶原蛋白表达的方法。
16、在一优选例中，所述重组ⅹⅶ型胶原蛋白是在大肠杆菌优选在大肠杆菌bl21(de3)中表达，包括以下步骤：
17、1）将所述的基因连接到载体pet28a上获得重组载体；
18、2）将所述的重组载体转染至大肠杆菌bl21(de3)中获得重组细胞；
19、3）培养所述的重组细胞后，离心，收集上清液；
20、4）从所述的上清液中分离纯化获得所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白。
21、更优选地，还包括将编码羟化酶bap4h的基因片段，构建到表达载体pcdfduet-1上获得重组载体pcdfduet-1-bap4h，转染至大肠杆菌bl21(de3)。
22、更优选地，步骤3）所述的培养包括加入终浓度为10mg/ml 的抗坏血酸、1mm feso4和1mm的iptg诱导表达目的蛋白，能够使目的蛋白的热稳定性进一步提高。
23、在另一优选例中，所述重组ⅹⅶ型胶原蛋白是在大肠杆菌优选在毕赤酵母gs115中表达，包括以下步骤：
24、1）将所述的基因连接到载体ppiczαa上获得重组载体；
25、2）将所述的重组载体转染至毕赤酵母gs115中获得重组细胞；
26、3）培养所述的重组细胞后，离心，收集上清液；
27、4）从所述的上清液中分离获得所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白。
28、更优选地，还包括将编码羟化酶bap4h的基因片段，构建到表达载体ppic9k上获得重组载体ppic9k-bap4h，转染至毕赤酵母gs115。
29、xvii型胶原蛋白除了是皮肤老化和创伤修复的关键因子，还是维持毛囊干细胞防止脱发和白发等具有重要作用。col17a1在毛囊干细胞（hfscs）中高度表达，col17a1对维持毛囊干细胞和黑素细胞干细胞（mscs）至关重要（shintaro tanimura，2011年）。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、生物可降解性而被广泛研究和应用于生物材料领域，如组织工程支架、可吸收缝合线等。
30、因此，本发明的第三目的是提供所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白、所述制备方法制备获得的重组ⅹⅶ型胶原蛋白包括有以下任一项中的应用：
31、i）促进细胞黏附；
32、ii）促进细胞增殖；
33、iii）促进细胞迁移；
34、iv）制备化妆品；
35、v）制备医用材料。
36、所述的促进细胞增殖，可以作为培养液基本成分促进细胞增殖，包括应用于体外毛囊干细胞或毛囊组织的培养和保存。
37、所述的促进细胞迁移，可以作为培养液基本成分促进细胞迁移，包括应用于体外毛囊干细胞或毛囊组织的培养和保存。
38、所述的化妆品包括但不限于护肤液、护肤霜、精华水、面膜、头皮精华液、洗发露。
39、所述的医用材料包括但不限于填充材料、修复材料、植入剂、组织工程支架、止血剂、药物释放载体，其中修复材料包括但不限于骨修复材料、创面敷料、缝合线。
40、本发明还提供一种包括美容上或药学上有效量的至少一种根据前述的蛋白以及至少一种赋形剂或美容上或药学上可接受的佐剂的组合物。在一些实施方式中，所述组合物的剂型包括但不限于膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥类、贴类、膜类或冻干类；进一步地，为了促进胶原蛋白分子透皮吸收，可以利用无纺布等固体载体制备成贴类产品，贴敷于面部，延长胶原蛋白液与皮肤表面的作用时间。本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白可与重组或天然的i型胶原蛋白、ⅱ型胶原蛋白、ⅲ型胶原蛋白、iv型胶原蛋白、v型胶原蛋白、纤连蛋白、人表皮生长因子等生物活性成分串联制备使用，还可以与上述生物活性成分在分别制备后混合使用。
41、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
42、1）本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白，理论分子量约为32.5kda，显著小于天然全长的胶原蛋白（150kda），为胶原蛋白穿过皮肤屏障发挥生物学功能减少障碍；
43、2）本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白具有高级的三螺旋结构，分子结构稳定 ，优选蛋白热稳定性能够维持在41℃；
44、3）本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白序列是基于人ⅹⅶ型胶原的原始氨基酸序列，优化选择其中生物活性高、稳定高级结构的部分，得到了全新的重组ⅹⅶ型胶原蛋白序列，具有良好生物相容性等特点；
45、4）本发明重组ⅹⅶ型胶原蛋白具有非常良好的促细胞黏附活性、促细胞增殖活性和促细胞迁移活性。
1.一种重组ⅹⅶ型胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列包含n个核心单元，其中n是1或大于1的整数，所述核心单元的氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白，其特征在于，所述n选自1、2、3中的任一个数值。
3.编码权利要求1或2所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的基因。
4.表达权利要求1或2所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的基因。
5.表达权利要求1所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中转染有权利要求4所述的重组载体。
6.权利要求1所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括将编码羟化酶bap4h的基因片段，构建到表达载体pcdfduet-1上获得重组载体pcdfduet-1-bap4h，转染至大肠杆菌bl21(de3)。
8.权利要求1所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括将编码羟化酶bap4h的基因片段，构建到表达载体ppic9k上获得重组载体ppic9k-bap4h，转染至毕赤酵母gs115。
10.权利要求1所述的重组ⅹⅶ型胶原蛋白、权利要求6或8所述制备方法制备获得的重组ⅹⅶ型胶原蛋白包括有以下任一项中的应用：
