本发明涉及一种对新冠病毒原始株和变异株s-rbd具有ph依赖结合特性的纳米抗体改造及其潜在应用，属于生物。
背景技术：
1、研究表明，sars-cov-2仍在产生新的突变，先前的疫苗针对其后产生的主要流行的突变株的保护效果不佳，尤其是基于原始株设计的疫苗(yang,h.,xie,y.&li,c.understanding the mechanisms for covid-19vaccine’s protection againstinfection and severe disease.expertrev vaccines 22,186–192(2023))。因此，必须进一步研究sars-cov-2及其变异株，并针对这些毒株开发有效的疫苗，以防止新的变种引起突破性感染。
2、sars-cov表面的刺突蛋白(s)包含一个受体结合域(rbd)，可特异性识别血管紧张素转换酶2(ace2)以介导冠状病毒侵入宿主细胞(shang,j.et al.structural basis ofreceptor recognition by sars-cov-2.nature 581,221–224(2020).；mechanismsofsars-cov-2entry into cells.natrevmol cellbiol23,3–20(2022).)。冠状病毒的s蛋白，尤其是rbd，能够诱导中和抗体(nabs)和t细胞免疫反应，因此s蛋白和s-rbd是sars-cov-2疫苗研发的理想抗原靶点(efficacy and safety ofcovid-19vaccines:asystematic review andmeta-analysis ofrandomized clinical trials.vaccines(basel)9,467(2021).)。目前，针对新冠的重组蛋白疫苗主要成分均为s或s-rbd，而多种变异株s-rbd的组合能够提供更广谱的保护效果，因此新冠病毒原始株和变异株s-rbd的制备效率和纯度对疫苗研发具有重要意义。目前主要有两大类针对s-rbd的亲和纯化技术：一种是通过在s-rbd上连接纯化标签如his、fc等进行纯化表达，通过纯化填料与标签的结合实现目的蛋白的富集，再切除s-rbd上的纯化标签，实验步骤复杂且可能会收获纯化标签的切割不完全的目的蛋白；另一种是一步纯化法，将纯化填料直接与s-rbd结合，可直接通过100mm醋酸钠缓冲液(ph 3.5)洗脱得到高纯度s-rbd蛋白，极端酸性的缓冲液对s-rbd及s蛋白的生物活性及稳定性造成显著影响。
3、因此，亟需一种能够提高s-rbd蛋白纯度、操作步骤简单、获得稳定性高且具有广谱性s-rbd蛋白的方法。
技术实现思路
1、在不同ph条件下，将待筛选的高纯度纳米抗体蛋白与野生型s-rbd混合，利用分子排阻层析手段分析纳米抗体与s-rbd的结合状态，并通过spr表征其动力学参数。进一步，利用氨基偶联手段将纳米抗体蛋白偶联至空白的固相载体(琼脂糖纯化填料)表面，模拟在不同洗脱条件下(ph、buffer组分等)纯化野生型s-rbd及其突变体，通过sds/page以及考马斯亮蓝染色法评估填料的纯化效率。最终，筛选得到mnb-11、mnb-14两种纳米抗体，具备与s-rbd及s蛋白ph依赖的结合特性，进一步固定化至琼脂糖微球，在中性ph条件下可稳定结合s-rbd(野生型及突变株)而在弱酸性条件下即可完全将其洗脱，可应用于亲和纯化新冠s-rbd及s蛋白。
2、本发明的第一个目的是提供一种纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq idno.1～3任一所示，所述纳米抗体能与新型冠状病毒刺突蛋白和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域结合。
3、在一种实施方式中，所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒野生毒株以及新型冠状病毒突变毒株。
4、在一种实施方式中，所述突变新型冠状病毒包括beta、delta、ba.4/5、xbb.1.5、ch.1.1、ba.2.86。
5、在一种实施方式中，所述纳米抗体的序列连接标签蛋白。
6、在一种实施方式中，所述标签蛋白包括6×his。
7、本发明的第二个目的是提供编码所述纳米抗体的基因。
8、本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。
9、本发明的第四个目的是提供表达所述基因或携带所述载体的宿主细胞。
10、本发明的第五个目的是提供一种纯化填料，所述纯化填料用于纯化新型冠状病毒刺突蛋白和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域，所述纯化填料包括所述纳米抗体。
11、在一种实施方式中，所述纳米抗体与固相载体偶联。
12、在一种实施方式中，所述固相载体包括亲和层析介质。
13、在一种实施方式中，所述亲和层析介质以苯乙烯、丙烯酸酯、葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺葡聚糖为基质。
14、本发明的第六个目的是提供制备所述纯化填料的方法，所述方法为将所述纳米抗体偶联至固相载体上。
15、在一种实施方式中，所述固相载体包括亲和层析介质。
16、在一种实施方式中，所述亲和层析介质以苯乙烯、丙烯酸酯、葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺葡聚糖为基质。
17、本发明的第七个目的是提供上述纯化填料在新型冠状病毒刺突蛋白纯化和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域纯化中的应用。
18、在一种实施方式中，所述应用包括制备纯化试剂或纯化试剂盒。
19、本发明还提供了一种纯化试剂盒，所述试剂盒中含有所述纯化填料。
20、在一种实施方式中，所述试剂盒中含有缓冲液和重力柱。
21、在一种实施方式中，所述缓冲液包括缓冲液i，缓冲液ii和缓冲液iii；所述缓冲液i为15～20mm hepes，900mm～1500mm nacl，ph7.5；所述缓冲液ii为80～120mmnaac，120～180mmnacl，ph5.0；所述缓冲液iii为80～120mm naac，120～180mmnacl，ph4.5。
22、本发明提供了一种纯化新型冠状病毒刺突蛋白纯化和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域的方法，所述方法为利用所述纯化填料或所述纯化试剂盒进行新型冠状病毒刺突蛋白纯化和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域的纯化。
23、在一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：
24、s1、结合：将待纯化的样品与所述纯化填料混合并孵育；
25、s2、装柱：将s1中孵育后的混合液加入至重力柱中，截留纯化填料；
26、s3、洗杂：向装有纯化填料的重力柱中滴入ph中性的高盐缓冲液，流穿，重复3次；
27、s4、洗脱：向洗杂后的重力柱中滴入ph弱酸性的洗脱缓冲液，收集流穿液，重复4次。
28、在一种实施方式中，s1中，2～6℃混合孵育50～70min。
29、在一种实施方式中，s3中，所述高盐缓冲液包括15～20mm hepes，900mm～1500mmnacl。
30、在一种实施方式中，s4中，所述洗脱缓冲液包括80～120mmnaac，120～180mmnacl，ph 5.0。
31、在一种实施方式中，在步骤s4洗脱之后，利用ph 4.5的再生缓冲液对所述纯化填料进行再生，所述再生缓冲液包括80～120mm naac，120～180mmnacl。
32、有益效果：
33、1、本发明提供的基于seq id no.1～3任一所述的纳米抗体s-rbd制备的亲和纯化填料是目前结合新冠s蛋白及s-rbd蛋白范围最广、洗脱条件最温和的亲和纯化填料。该填料直接靶向s-rbd，实现无标签目的蛋白的一步纯化，纯化的目的蛋白纯度极高，并且洗脱条件温和(ph 7.5条件下与目的蛋白结合，在ph 5.0条件下即可充分洗脱)，在提高纯化效率的同时有效保护目的蛋白的构象稳定和生物活性。
34、2、由于纳米抗体靶向s-rbd的保守区域，广泛结合新冠突变体s-rbd蛋白，是目前针对新冠突变体s-rbd范围最广、纯化效果最好的亲和纯化填料，由于其结合位点的保守性，目前尚未有流行突变株在该位点发生突变，可以确定其对目前所有流行突变株(beta、delta、ba.4/5、xbb.1.5、ch.1.1、ba.2.86)的s-rbd及s蛋白均能纯化。在填料可持续使用方面，改造后的纳米抗体依然具备极强的稳定性和高产率，在ph 4.5条件下可以实现对纳米抗体s-rbd亲和纯化填料再生，在保证填料耐用性的同时节约填料的生产时间，极大提高填料的生产效率，降低生产成本和使用成本。
35、本发明提供的纳米抗体mnb-11、mnb-13、mnb-14具备广泛的应用价值，可用于全部s-rbd及s蛋白的生产、纯化、结合/解离等场景，如新冠相关的一般性实验，包括特异性结合/解离，蛋白制备等过程，尤其适用于高纯度无标签目的蛋白的生产，如疫苗生产、免疫抗原制备等。
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1～3任一所示，所述纳米抗体能与新型冠状病毒刺突蛋白和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域结合。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒野生毒株以及新型冠状病毒突变毒株；可选地，所述突变新型冠状病毒包括beta、delta、ba.4/5、xbb.1.5、ch.1.1、ba.2.86。
3.编码权利要求1或2所述纳米抗体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的载体或宿主细胞。
5.一种纯化填料，其特征在于，所述纯化填料用于纯化新型冠状病毒刺突蛋白和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域，所述纯化填料包括权利要求1或2所述纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的纯化填料，其特征在于，所述纳米抗体与固相载体偶联。
7.权利要求5或6所述的纯化填料在新型冠状病毒刺突蛋白纯化和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域纯化中的应用；可选地，所述应用包括制备纯化试剂或纯化试剂盒。
8.一种纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求5或6所述纯化填料。
9.一种纯化新型冠状病毒刺突蛋白纯化和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求5或6所述纯化填料或权利要求8所述纯化试剂盒进行新型冠状病毒刺突蛋白纯化和/或新型冠状病毒刺突蛋白受体结构域的纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
