本发明属于生物检测，具体涉及一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法及应用。
背景技术：
1、肠道菌群与葡萄糖代谢、脂代谢密切相关，其中部分菌群通过调节胆汁酸(bas)代谢进而影响多个bas受体信号传导途径。肝脏胆固醇经肝酶代谢，合成初级胆汁酸。胆汁酸(bas)拥有多样的化学结构和生物功能，合成途径包括经典途径(主要产生12α-羟基胆汁酸，胆酸)和替代途径(主要产生非12α-羟基胆汁酸，鹅去氧胆酸)。bas合成和排泄是胆固醇和脂代谢的主要途径，因此与多种代谢性疾病有关，包括肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等。此外，羟化固醇和bas均可作为信号分子，激活多种组织中的多个核和膜受体介导的信号途径，调节葡萄糖，脂质稳态，炎症和能量消耗。调节bas合成和组成以调节bas信号传导是代谢性疾病治疗的潜在策略。
2、12α-羟基胆汁酸(12hbas)/非12α-羟基胆汁酸(非12hbas)的比值增高通常与代谢紊乱有关，如胰岛素抵抗和肝脂肪变性。相反，非12hbas的比例增加有助于减少脂质吸收和改善葡萄糖耐量。此外，熊去氧胆酸(udca)和石胆酸(lca)等非12hbas药物在原发性胆汁性胆管炎、肝纤维化和非酒精性脂肪肝的临床治疗中显示出有益的结果。
3、基于bas的同分异构体众多、标准品有限等特点，想要从复杂的生物基质中准确识别和区分12hbas和非12hbas面临相当大的挑战，目前也无法在不依赖标准品的情况下全局区分12hbas和非12hbas。贾刚田提出过一种血中12α-羟基胆汁酸的微量酶法测定技术，其研究用12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)测定血中12α-羟基胆汁酸，但是其公开的其实是胆酸(ca)与脱氧胆酸(dca)的简易酶比色法，使具有12α-羟基的ca、dca出现特异性反应，吸收强度显示游离型＞甘氨酸结合型＞牛磺酸结合型，这种方法的不足在于，其可较为明显地鉴定出游离型12hbas，而在鉴定结合型12hbas时的准确性则不是很理想。
4、高分辨质谱(hrms)检测范围广，能提供丰富的结构信息，是鉴定复杂样品中bas的重要技术。众多研究聚焦于特征碎片和化学衍生化技术以实现bas异构体的区分和检测。但是，需要注意的是，只有游离12hbas可以产生明确的特征性碎片，大量结合类型的12hbas无法依赖诊断碎片区分。
5、再者，寻找一种针对特定位点的特异性化学试剂十分困难。王志臻曾在其硕士学位论文“3α-羟类固醇脱氢酶的密码子优化表达、亲和纯化及酶性质研究”中通过优化3α-hsdh基因密码子，合成3α-hsdh基因全序，其以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)为辅基，能可逆地催化类固醇分子中第三位上羟基的氧化与还原。其虽是一种针对特定位点的特异性化学试剂，但是其在临床上主要是用来检测血清中总胆汁酸的含量的关键酶，也不能用于区分和识别12hbas和非12hbas。
6、随着合成生物学的快速发展，拓展了bas代谢反应的解析。为了精确区分12hbas与非12hbas，开发一种生物酶辅助的质谱方法实现12hbas和非12hbas的区分十分有必要。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种肠道微生物编码的12α-羟类固醇脱氢酶(12α-hsdh)辅助的液质联用(lc-ms)方法识别12hbas，从而区分12hbas与非12hbas的方法与应用。
2、本发明的技术方案为：一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，该方法基于由迟缓埃格特菌株dsm 2243编码的12α-hsdh进行，并对12α-hsdh基因序列进行密码子优化，优化后的12α-hsdh在体外特异性催化12hbas的脱氢反应，优化后的12α-hsdh全长基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
3、具体检测过程如下：
4、(1)使用两份相同的胆汁酸样品a和b，样品b中投入12α-hsdh溶液和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)，样品a不加12α-hsdh，用作阴性对照，反应在中性缓冲液中进行；
5、(2)反应混合物中加入有机试剂液液萃取，静置分层后，转移出有机层，吹干，残留物重新溶解在内标溶液中，离心后，上清液进入仪器分析；
6、(3)对上清液进行超高效液相色谱串联质谱分离检测：利用高效液相色谱对步骤(1)制备的样品a和b进行分离，再通过质谱检测样品a和b中的bas质荷比的响应；
7、(4)将步骤(3)采集的数据，使用同位素内标相对定量，得到样品a和b中bas的峰面积a，定义bas的转化率为(1-ab/aa)％，其中，ab为样品b的峰面积、aa为样品a的峰面积，通过bas标准品制定转化率指标识别12α羟基胆汁酸。
8、进一步地，(1-ab/aa)％值在60％-100％的配对峰为12hbas。
9、进一步地，步骤(1)中所用中性缓冲液为ph值6-10的磷酸二氢钾缓冲液或tris-hcl缓冲液，反应在30-50℃下持续6-24小时。
10、进一步地，步骤(2)中所用有机试剂为乙酸乙酯，反应混合物与有机试剂的体积比为1:1～4。
11、进一步地，步骤(3)中，高效液相色谱条件为：色谱柱：waters acquity c18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相组成：含0.1％甲酸的水(a)和乙腈(b)；流动相b的线性梯度洗脱条件为：5％(0.0-0.5min)，5％至35％(0.5-2.0min)，35％至65％(2.0-35.0min)，65％至100％(35.0-36.0min)，100％(36.0-44.0min)，100％至5％(44.0-45.0min)，然后在5％下停留5.0min，流速设定为0.2ml/min，柱温为35℃，进样体积为2μl。
12、进一步地，步骤(3)中，质谱条件为：在电喷雾电离(esi)模式下，采用dda-ms采集周期为874ms，包括ms1累积时间(100ms，质量扫描范围150-800da)和ms2累积时间(50ms，质量扫描范围50-800da)，离子源在负离子模式下运行，设置如下：离子喷雾电压浮动(isvf)-4500v，离子源气体1(gs1)55psi，离子源气体2(gs2)55psi，帘式气体(cur)40psi，电喷雾离子源温度550℃，除杂电位(dp)-90v，碰撞能量(ce)-45±15v。
13、进一步地，密码子优化后的12α-hsdh全长基因经表达和纯化后得到目标蛋白，表达和纯化过程如下：
14、1)将seq id no.1所示基因克隆至带有n端6×his标签的表达载体中，得到重组质粒；
15、2)将重组质粒转化e.coli bl21(de3)细胞，得到重组表达转化体；
16、3)将步骤2)得到的重组表达转化体大肠杆菌系统中诱导表达；
17、4)采用ni-nta琼脂糖柱纯化目标蛋白。
18、进一步地，步骤(1)中，所述表达载体为pet-22b(+)质粒载体。
19、相比于现有技术，本发明具有如下优点：
20、1、本技术开发了一种酶驱动液相色谱-高分辨质谱方法，以酶转化率为指标来鉴定12hbas和非12hbas；这种方法有两个主要功能：第一项功能是全局筛选，可从混合生物样品中鉴定出12hbas；第二个功能是异构体区分，建立的bas谱，提供c12位点的羟基信息；
21、2、12α-hsdh可直接在大肠杆菌异源表达系统中合成，易于获得，其以来源于迟缓埃格特菌株dsm 2243编码的12α-hsdh(ncbi编号：wp_009306643)为模板，对12α-hsdh基因进行序列分析，根据克隆受体菌大肠杆菌中的密码子偏爱性进行密码子优化以提高生物酶基因外源表达量；
22、3、本技术合成的12α-hsdh位点特异性高，只与12羟基发生反应，可在温和条件下于体外高效、特异性的与12hbas反应，为结合液质联用技术确定bas的反应转化率提供基础，可以支持从复杂的生物基质中高通量识别12hbas；
23、4、本技术公开的酶催化反应效率高，条件温和，操作简单，且酶试剂无毒，对环境友好；
24、5、本技术提供的酶辅助液质联用方法识别12hbas的实用性由监测12hbas和非12hbas在哮喘病中的变化验证，这就说明本技术提供了一种新的模式来诊断不同病理生理状态下bas的代谢转变，这种技术有望应用到诊断和监测其他代谢疾病中12hbas和非12hbas的比例变化，进而为临床提供更准确的疾病诊断和治疗方案，具有良好的临床应用前景；
25、6、利用本技术公开的酶驱动液相色谱-高分辨质谱方法有望用于评估药物对12hbas和非12hbas水平的影响，进而用于评估候选药物的疗效和安全性。
1.一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，该方法基于由迟缓埃格特菌株dsm 2243编码的12α-hsdh进行，并对12α-hsdh基因序列进行密码子优化，优化后的12α-hsdh在体外特异性催化12hbas的脱氢反应，优化后的12α-hsdh全长基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
2.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，(1-ab/aa)％值在60％-100％的配对峰为12hbas。
3.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(1)中所用中性缓冲液为ph值6-10的磷酸二氢钾缓冲液或tris-hcl缓冲液，反应在30-50℃下持续6-24小时。
4.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(2)中所用有机试剂为乙酸乙酯，反应混合物与有机试剂的体积比为1:1～4。
5.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱条件为：色谱柱：waters acquity c18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相组成：含0.1％甲酸的水(a)和乙腈(b)；流动相b的线性梯度洗脱条件为：5％(0.0-0.5min)，5％至35％(0.5-2.0min)，35％至65％(2.0-35.0min)，65％至100％(35.0-36.0min)，100％(36.0-44.0min)，100％至5％(44.0-45.0min)，然后在5％下停留5.0min，流速设定为0.2ml/min，柱温为35℃，进样体积为2μl。
6.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱条件为：在电喷雾电离(esi)模式下，采用dda-ms采集周期为874ms，包括ms1累积时间(100ms，质量扫描范围150-800da)和ms2累积时间(50ms，质量扫描范围50-800da)，离子源在负离子模式下运行，设置如下：离子喷雾电压浮动(isvf)-4500v，离子源气体1(gs1)55psi，离子源气体2(gs2)55psi，帘式气体(cur)40psi，电喷雾离子源温度550℃，除杂电位(dp)-90v，碰撞能量(ce)-45±15v。
7.如权利要求1所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，密码子优化后的12α-hsdh全长基因经表达和纯化后得到目标蛋白，表达和纯化过程如下：
8.如权利要求7所述的一种识别12α羟基胆汁酸的酶辅助液质联用检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达载体为pet-22b(+)质粒载体。
