本发明属生物，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟的引物组、检测方法和应用。
背景技术：
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，该病临床上以高热、皮肤和内脏广泛性出血、腹泻、死亡为主要特征，其是目前已知的唯一的1个dna虫媒病毒。猪感染后死亡率高，能给全球养猪业带来较大经济损失。但目前仍无安全、有效和完全商业化推广的非洲猪瘟疫苗。随着疫情的发展，快速检测非洲猪瘟病毒技术成为养殖企业及时发现和防控非洲猪瘟疫情的一个手段。
2、asfv的基因组约170～193kb，含有150～167个开放阅读框(open readingframes，orfs)，编码150～200种蛋白质，其中约50多种是病毒的结构蛋白。同时asfv基因组还编码dna复制、基因转录和rna修饰酶类，以及调节宿主细胞功能和参与病毒免疫逃逸的相关蛋白。asfv编码的衣壳蛋白目前已知的有p72、p49(pb438l)和p14.5(pe120r)。p72产生于病毒感染晚期，由orf b646l基因编码，蛋白大小为73.2kd。p72作为asfv的重要抗原蛋白，是病毒二十面体的主要成分，对于病毒衣壳的形成至关重要。研究表明，p72蛋白作为afsv的主要衣壳蛋白在病毒感染后的晚期进行表达，保守性较强且免疫原性好，是目前研究最多的用于诊断的结构蛋白。在目前已知的病毒分离株中鉴定了24种不同的p72基因型。目前区分p72基因的方法可能不能代表p72表位的差异。asfv的突变率远高于其他常规dna病毒，有研究表明在ncbi查找和比对所有全长p72可以发现p72的突变很多。2020年12月新发行的《非洲猪瘟诊断技术》也将国内检测非洲猪瘟病毒的主要方法定为以asfv的p72基因保守序列为靶标建立的荧光定量pcr检测法。因此，p72蛋白的编码基因是afsv研究的重要基因之一。
3、自然感染asfv的潜伏期通常为3～5天，也有延长至19天的，oie法典规定的潜伏期为15天。一般在出现症状的两天前被感染的动物就开始传播病毒，感染七八天后血清开始转阳。针对早期诊断asf的抗原检测技术要优于抗体检测技术。荧光定量pcr检测法是检测核酸样品由定性到定量的转变，同时提高了核酸检测的敏感性、特异性及检测效率等，作为一种特异、灵敏、快速的检测方法，是应用于afs早期检测的一种必不可少的检测手段。在此方法中，pcr的扩增效率会因引物的位置和碱基组成不同而存在一定差异。
4、目前，对非洲猪瘟病毒检测除了基于聚合酶链式反应方法外，主要通过以下三种实验室检测方法进行检测：病毒的分离鉴定、抗体免疫组化、酶联免疫吸附。其中，病毒分离鉴定，体外扩增培养时间长，细胞培养对人员设备要求高，步骤繁琐；免疫组化，检测病料组织中的病毒，特异性较差，容易出现假阳性，操作过程复杂，对病料保存、处理等需要专业人员进行操作，操作过程中的差异对结果影响较大，需要检测者具有一定经验才能做出准确判断；酶联免疫吸附，结果较为准确，但对样品要求较高，要求新鲜病料才能检测准确，检测需要抗体，成本高，时间长，至少4～6小时才能有结果。对于前学者建立的荧光定量检测方法，检测的灵敏度较低，一般为数十个拷贝。
技术实现思路
1、基于qpcr技术，通过文献调研，设计可检测asfv的特异性引物，同时引入taqman探针提升检测灵敏度和特异性。许多有关非洲猪瘟病毒检测研究表明引物和探针组合可以满足qpcr实验的要求，因此并不总是需要使用最高质量的组合。无论设计工具的算法多么先进，探针引物的性能最终取决于实验数据以及是否有非特异性产物。扩增条件也需要通过实验不断优化，对引物和探针的浓度、退火温度进行优化。通过温度梯度实验证实最佳tm和优化寡核苷酸浓度。并在实验筛选后确定最佳引物组合，为后续的研究提供一定的材料支撑，建立一种高特异性、灵敏性的afsv taqman荧光定量检测方法，达到最低检测数为10拷贝。
2、本发明第一方面的目的，在于提供一种试剂。
3、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒的应用。
5、本发明第四方面的目的，在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量pcr检测方法。
6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
7、本发明的第一个方面，提供一种试剂，包括引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示，
8、上游引物：5’-aatagcagatgccgataccaca-3’，或为该序列的互补序列；
9、下游引物：5’-ctttgaagccacgggagga-3’，或为该序列的互补序列；
10、探针序列为：5’-agccgtagtgatagaccccacgtaatccg-3’，或为该序列的互补序列。
11、在本发明一些实施方式中，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团。
12、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团为fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red和cy5中的至少一种；优选为fam。
13、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种；优选为bhq1。
14、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团连接在探针的5’端。
15、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团连接在探针的3’端。
16、本发明的第二个方面，提供一种包含本发明第一方面的试剂的试剂盒。
17、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr反应液和阳性标准品。
18、在本发明一些实施方式中，所述pcr反应液为probe qpcr mix。
19、在本发明一些实施方式中，所述阳性标准品为质粒puc57-asfv-b646l。
20、本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
21、(1)鉴别非洲猪瘟病毒；
22、(2)制备检测或辅助检测非洲猪瘟病毒的产品；
23、(3)检测待测样品是否为非洲猪瘟病毒；
24、(4)制备检测或辅助检测待测样品是否为非洲猪瘟病毒的产品；
25、(5)检测待测样品是否感染非洲猪瘟病毒；
26、(6)制备检测或辅助检测待测样品是否感染非洲猪瘟病毒的产品；
27、上述应用用于非疾病的诊断和治疗。
28、本发明的第四个方面，提供一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量pcr检测方法，包括使用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
29、在本发明一些实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：
30、1)从待测样品中提取核酸；
31、2)以步骤1)的核酸为模板，用所述试剂或所述试剂盒进行实时荧光定量pcr扩增反应，收集荧光信号；
32、3)根据荧光信号判定待测样品中是否含有或是非洲猪瘟病毒。
33、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为50～300nm，上/下游引物终浓度为200～500nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
34、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为50～100nm，上/下游引物终浓度为200～400nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
35、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为50～100nm，上/下游引物终浓度为300～400nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
36、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应程序为：35～40℃，2～3min；94～96℃，20～40s；94～96℃，5～15s，55～65℃30～35s，40～45个循环。
37、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应程序为：35～37℃，2～3min；94～96℃，20～30s；94～96℃，5～10s，58～62℃30～35s，40～45个循环。
38、本发明的有益效果是：
39、本发明提供的试剂可用于对非洲猪瘟病毒进行检测，可快速检测鉴定非洲猪瘟病毒，且具备极高的检测敏感性与特异性，检测结果准确可靠。
40、本研究将建立一种高特异性、灵敏性的afsv taqman荧光定量检测方法，该方法仅特异性扩增asfv，不与其他猪瘟病毒发生交叉反应，特异性高，重复性强(组间与组内的重复性试验变异系数均小于1.8267％)。该方法的最低检测数为10个拷贝，显著低于目前基于酶重组酶扩增(era)技术的非洲猪瘟病毒(asfv)dna快速检测方法。阳性样品的拷贝数检测限均为100，结果相比较更为灵敏，实现asfv的高灵敏度、高通量、低成本检测，可用于今后afs的早期检测。
1.一种试剂，包括引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示，
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述荧光基团为fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red和cy5中的至少一种；和/或，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3中任一项所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应液和阳性标准品。
6.权利要求1～3中任一项所述的试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
7.一种检测非洲猪瘟病毒的实时荧光定量pcr检测方法，包括使用权利要求1～3中任一项所述的试剂和/或权利要求4或5所述的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为50～300nm，上/下游引物终浓度为200～500nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述实时荧光定量pcr扩增反应程序为：35～40℃，2～3min；94～96℃，20～40s；94～96℃，5～15s，55～65℃30～35s，40～45个循环。
