本发明属于分子细胞遗传学研究，具体涉及一种快速确定菊花19-20-21染色体的寡核苷酸探针及其应用。
背景技术：
1、菊花(chrysanthemum morifolium)隶属于菊科(asteraceae)春黄菊族(anthemideae)菊属(chrysanthemum)，是多年生草本植物。
2、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，fish)自出现后，历经不断发展与完善，在众多应用领域发挥着不可替代的作用。fish是分析祖先基因组来源，理清种间进化关系，解析染色体组组成的重要手段之一，也是鉴定异位系、附加系等染色体工程育种的重要手段，常规的荧光原位杂交技术在染色体的相关研究中应用广泛，主要的探针类型有重复序列探针、特异性染色体探针和单拷贝基因探针。重复序列探针在基因组功能分析、物种进化等方面具有重要作用，广泛存在在基因组中。其中，串联重复序列探针以首尾相连的方式形成串联重复序列单元，而散在的重复序列与其他类型的序列以交错的形式存在。主要包括有45srdna、5srdna、卫星序列dna等。fish实验中可以产生强烈的信号，且重复性较高，被广泛引用于染色体核型分析及染色体重排。
3、随着分子细胞遗传学发展，bac-fish、gish、chromosome painting等改进发展的fish技术层出叠现，目前最准确的且广泛应用的是通过全长染色体设计特异探针库进行染色体涂染。该方法得到的探针多用于植物染色体的研究，尤其是近缘物种不同材料间的染色体组成的鉴定和野生种质材料间的非同源染色体结构的识别，进一步为近缘物种的基因组测序提供细胞学依据，也为这些野生种质材料应用到杂交育种的遗传研究提供染色体标记。然而，chromosome painting探针的设计成本高昂且制备过程繁琐，以识别菊花单倍体19-20-21号寡核苷酸探针为例，需要共合成探针2-3万条，成本超过4万元。传统的fish分析中常规使用的重复序列探针例如小麦pta71(45s rdna)探针，其中来源于小麦的异源片段的干扰信号也会对实验结果产生影响，存在难以识别的问题。因此，有必要开发更便利的探针来识别菊花单倍体及菊属植物不同物种间染色体。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种快速确定菊花19-20-21染色体的寡核苷酸探针，基于菊属植物及其近缘属参考基因组数据的5s rdna设计。本发明的第二目的是提供了上述寡核苷酸探针的开发方法和应用。
2、技术方案：本发明的快速确定菊花19-20-21染色体的寡核苷酸探针，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、本发明的上述寡核苷酸探针的开发方法，包括以下步骤：
4、(1)对多种菊科植物进行基因序列比对，获得共有的基因序列；
5、(2)基于共有的基因序列，设计双端tamra修饰的寡核苷酸探针；
6、(3)对获得的寡核苷酸探针进行荧光原位杂交验证，与全长染色体探针库中19-20-21染色体探针涂染结果比对，获得可以快速确定菊花19-20-21染色体的寡核苷酸探针。
7、其中，步骤(1)中所述的菊科植物包括菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵。
8、其中，步骤(1)中所述共有的基因序列为5s rdna，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
9、其中，步骤(2)中设计的寡核苷酸探针包括核苷酸序列如seq id no.1～4所示的探针。
10、其中，步骤(2)中设计的寡核苷酸探针长度为25-35nt。
11、本发明的快速确定菊花19-20-21染色体的方法，包括以下步骤：向菊花染色体制片上滴加含有上述的寡核苷酸探针的探针杂交液进行杂交，杂交结束后进行洗片和荧光显微镜镜检，oligo-panting与寡核苷酸探针荧光信号共定位的染色体为菊花19-20-21染色体。
12、其中，所述探针杂交液还包括2×ssc+1×te。
13、其中，所述寡核苷酸探针浓度为0.55ng/μl。
14、其中，所述菊花染色体制片选用有丝分裂中期的根尖细胞。
15、具体的：(1)将有丝分裂中期制片常温下置于碱变液中变性1min，接着依次置于体积百分比为70％乙醇、90％乙醇和100％乙醇的溶液中，室温下依次梯度脱水5min后晾干备用，滴加上述的杂交液，滴加量为8.5μl/片，盖上盖玻片并用封片胶封片，待胶水自然干燥后将制片于润湿的湿盒中37℃过夜杂交12h以上；
16、(2)过夜杂交后取出制片进行撕胶、去盖玻片处理，后置于室温条件下2×ssc、2×ssc、ddh2o溶液中浸洗3min，3min和10s，晾干后在制片上滴加10μl dapi封片；镜检。
17、其中，所述步骤(1)中的碱变性液是由naoh与体积百分比为70％的乙醇以6g/l的比例溶解混匀配制而成。
18、其中，步骤(2)镜检具体为将封片后的染色体制片置于olympus bx60型荧光显微镜下镜检，利用spot ccd拍摄菊花单倍体有丝分裂中期染色体图像，并通过photoshop(2023)对获得的图像进行处理。
19、本发明中对菊属植物染色体进行fish分析时，采用单链寡核苷酸探针组配成的寡核苷酸探针套代替传统的质粒探针，显示出与来源于其他植物的质粒探针相同或更多同源的杂交信号，有助于获得高分辨率的菊属植物有丝分裂中期染色体核型。
20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明的筛选到的寡核苷酸探针可实现1条探针即可定位19-20-21号染色体可有效的用于菊花单倍体染色体19-20-21的识别，方法简单易行，可操作性强，实用性非常突出；在进行fish检测时，通过简单变性即可用于检测，相较于传统的fish程序，大大简化了荧光原位杂交探针的制备和标记、分析方法，进一步帮助实验效率的提高；检测时，可得到明亮且清晰的fish信号，同时杂质信号易洗脱，有利于获得更好的fish核型，为进一步设计特异性寡核苷酸探针提供有效依据；也为明晰菊属下各种的差异提供了新的途径，有助于菊花单倍体及菊属植物的分子细胞遗传学研究。
1.一种快速确定菊花19-20-21染色体的寡核苷酸探针，其特征在于，所述寡核苷酸探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种开发权利要求1所述的寡核苷酸探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的菊科植物包括菊花脑、甘野菊、黄蒿和向日葵。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述共有的基因序列为5srdna，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中设计的寡核苷酸探针包括核苷酸序列如seq id no.1～4所示的探针。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中设计的寡核苷酸探针长度为25-35nt。
7.一种快速确定菊花19-20-21染色体的方法，其特征在于，包括以下步骤：向菊花染色体制片上滴加含有权利要求1所述的寡核苷酸探针的探针杂交液进行杂交，杂交结束后进行洗片和荧光显微镜镜检，oligo-panting与寡核苷酸探针荧光信号共定位的染色体为菊花19-20-21染色体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述探针杂交液还包括2×ssc+1×te溶液。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探针浓度为0.55ng/μl。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述菊花染色体制片选用有丝分裂中期的根尖细胞。
