本发明属于生物工程，具体涉及一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术：
1、起初，抗生素的出现虽然为治疗各种细菌感染提供了有效保障，但抗生素的滥用导致了细菌耐药性的出现。目前，抗生素的研发速率远不及细菌产生耐药的速度，这使得人们处于无药可用的境地。因此人们迫切寻求新型的药物以替代传统抗生素。相较于传统抗生素，抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)来源广泛，对多种细菌、多重耐药细菌均具有抗菌活性，并且其作用机制主要作用于细菌细胞膜，不易产生耐药性。因此，抗菌肽被认为是抗生素的理想替代物。
2、但目前抗菌肽的开发与应用仍然存在诸多限制，如生物体内的天然抗菌肽提取困难，部分天然抗菌肽具有体内不稳定性、易被消化道中各种蛋白酶降解的问题，这造成绝大多数只能局部给药或静脉给药，大大限制抗菌肽的应用范围。研究表明，在多肽序列中合理引入非天然氨基酸是一种常见的提高抗菌肽对各种蛋白酶抗性的修饰策略。但与此同时，非天然氨基酸的引入可能会引起体内毒性升高，导致富含非天然氨基酸的多肽依旧无法真正实现体内应用，因此我们需要尽量避免非必要的毒性产生。树状支链抗菌肽是在传统线性抗菌肽基础上引入分支点构建分支结构的一种新型抗菌肽设计策略，有研究表明该策略通过降低抗菌肽的螺旋度改变其二级结构进而大幅降低其溶血活性及毒性。因此，合理设计一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽一方面通过非天然氨基酸修饰提高了其在消化道环境中的稳定性，另一方面通过分支设计降低其对动物体的毒性，有望实现抗菌肽的口服给药。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr，解决现有的天然抗菌肽存在的酶稳定性差，导致难以口服给药的问题。
2、本发明所采用的技术方案如下：一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr，包括一个lys和两组α-螺旋结构的七肽基团，所述的七肽基团的氨基酸序列为：lwdabldabwdr，其中，dab为2,4-二氨基丁酸，dr为d型arg，第一组所述的七肽基团的第7位的d型arg的c端与lys的ε-n端相连，第二组所述的七肽基团的第1位的leu的n端与lys的c端相连，并且所述的抗菌肽kdabr的c端采用-nh2酰胺化。
3、进一步的，如上所述的一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr，其分子式如式(i)所示，
4、
5、本发明的另一目的是提供如上所述的一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr的制备方法，步骤如下：
6、s1：以α-螺旋七肽重复序列“abcdefg”为模板，选择leu放置在a、d位置上形成稳定α-螺旋结构的leu拉链；在b和f位置添加trp，以trp-trp相互作用来进一步提高α-螺旋结构稳定性，从而提高抗菌活性，在c、e和g位置分别添加dab、dab、d型arg以增加正电荷数，得到七肽基团的氨基酸序列为：lwdabldabwdr，将第一组七肽基团的第7位的d型arg的c端与lys的ε-n端相连，将第二组七肽基团的第1位的leu的n端与lys的c端相连，得到多肽，并且进一步在多肽的c端采用-nh2酰胺化；
7、s2：将所述的多肽采用固相化学合成法进行合成，再经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，对所述的多肽进行抑菌活性检测、溶血活性检测以及蛋白酶稳定性检测，最终命名为树状支链抗菌肽kdabr。
8、本发明的另一目的是提供如上所述的一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr在制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
9、进一步的，所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌或表皮葡萄球菌。
10、进一步的，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、绿脓杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
11、本发明具有如下优点及有益效果：本发明通过合理引入非天然氨基酸并构建分支结构的修饰策略显著提高了多肽在胰蛋白酶以及模拟肠液中的稳定性，同时降低了抗菌肽的毒性，有望实现抗菌肽的口服给药。对得到的富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr进行抗菌和溶血活性以及酶稳定性检测，发现树状支链抗菌肽kdabr对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌等几种测定的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有较高抑菌活性。同时树状支链抗菌肽kdabr具有最佳细胞选择性，其治疗指数(ti)为112.77。除此之外，树状支链抗菌肽kdabr在人工肠液(simulatedintestinal fluid，sif)中仍然能够发挥稳定高效抗菌作用。综上所述，树状支链抗菌肽kdabr有潜力成为治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物，并在肠道中维持较高抗菌活性，有望实现口服给药。
1.一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr，其特征在于：包括一个lys和两组α-螺旋结构的七肽基团，所述的七肽基团的氨基酸序列为：lwdabldabwdr，其中，dab为2,4-二氨基丁酸，dr为d型arg，第一组所述的七肽基团的第7位的d型arg的c端与lys的ε-n端相连，第二组所述的七肽基团的第1位的leu的n端与lys的c端相连，并且所述的抗菌肽kdabr的c端采用-nh2酰胺化。
2.如权利要求1所述的一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr，其特征在于，分子式如式(i)所示，
3.如权利要求1所述的一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr的制备方法，步骤如下：
4.如权利要求1所述的一种富含非天然氨基酸的树状支链抗菌肽kdabr在制备治疗由革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌或表皮葡萄球菌。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、绿脓杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
