本发明涉及生物医药，尤其涉及一种cd19+tams靶向杀伤剂及其提升免疫治疗疗效的应用。
背景技术：
1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，car-t)疗法主要是利用基因修饰技术，使t细胞装上导航装置car，从而激活t细胞，释放大量效应因子，识别并杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。cd19 car-t细胞已批准用于血液系统肿瘤，但一般认为实体瘤的肿瘤细胞不表达cd19，至今尚无将cd19 car-t细胞用于治疗实体瘤的尝试。肝癌细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是我国第二位引起肿瘤相关死亡的疾病。作为一种代表性的恶性实体瘤，大部分患者在发现时已处于晚期阶段，丧失了手术切除的机会。虽然免疫治疗如抗pd-1/pd-l1中和抗体等已广泛应用于肝癌的晚期治疗，但由于肝癌实体瘤中免疫细胞难浸润、缺乏有效靶点等原因，许多患者免疫治疗效果并不理想，甚至出现了免疫耐受的现象。目前关于car-t在肝癌等实体瘤中的应用还处于早期阶段。
2、巨噬细胞是机体内特别是肿瘤中含量最丰富的免疫细胞，特别地，肿瘤中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，tams)，在肿瘤发生发展及免疫耐药发生过程中发挥重要作用。传统地，tams可被划分为促炎的m1型tams和抑炎的m2型tams，肿瘤中的tams主要为m2型tams，发挥促癌作用。然而近几年来，随着质谱流式、单细胞测序、空间组学等高通量技术的发展，有学者研究发现，肿瘤中的tams不是简单的两极分化状态，可由多种巨噬细胞表型共同构成。因此识别出促进肝癌进展的关键巨噬细胞亚群，并研发出针对性免疫疗法对改善肝癌患者预后意义重大。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种cd19+tams靶向杀伤剂及其提升免疫治疗疗效的应用，为精准免疫疗法提供了一种新途径。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种cd19+tams靶向杀伤剂，所述cd19+tams靶向杀伤剂中含有cd19car-t细胞。
4、优选的，所述cd19+tams靶向杀伤剂通过静脉回输发挥作用。
5、优选的，所述cd19 car-t细胞通过逆转录病毒转染方法构建得到。
6、优选的，所述逆转录病毒转染方法具体包括以下步骤：
7、cd19 car通过限制性内切酶ecori和bamhi插入逆转录病毒表达载体骨架pmscv-ires-gfp ii中，得到包含cd19 car的逆转录病毒质粒；通过polybrene和磷酸钙转染法得到cd19 car-t细胞。
8、优选的，所述cd19 car序列中包括鼠cd8a信号肽、anti-mouse cd19scfv、鼠cd8a铰链区和跨膜区、cd28信号和cd3ζ的包浆信号。
9、优选的，所述cd19 car的核苷酸序列如seq id no.1所示；
10、所述cd19 car氨基酸序列如seq id no.2所示。
11、本发明还提供了上述cd19+tams靶向杀伤剂在提升实体瘤患者免疫治疗疗效中的应用。
12、本发明还提供了上述cd19+tams靶向杀伤剂的应用，所述cd19+tams靶向杀伤剂以非治疗目的回输至富含cd19+tams的双侧皮下瘤小鼠模型中。
13、优选的，所述富含cd19+tams的双侧皮下瘤小鼠模型通过包括以下步骤的构建方法得到：
14、(1)小鼠脾脏单细胞悬液获取；
15、(2)流式分选得到cd19+巨噬细胞和cd19-巨噬细胞；
16、(3)cd19+巨噬细胞和cd19-巨噬细胞分别与肝癌细胞混合种植于同一只小鼠左右两侧腋下。
17、优选的，所述cd19+巨噬细胞和cd19-巨噬细胞是通过流式分选脾脏组织单细胞悬液得到，再分别与肝癌细胞混合种植，形成皮下瘤。
18、本发明的有益效果：
19、本发明证明了利用cd19 car-t靶向杀伤cd19+tams治疗实体瘤的细胞治疗策略是成功的；本发明构建的cd19 car-t靶向杀伤肝癌中cd19+tams的小鼠模型，其特点为改变传统的car-t细胞杀伤肿瘤细胞模式，利用car-t细胞靶向杀伤促癌的肿瘤相关巨噬细胞，逆转肿瘤免疫抑制性微环境；本发明的研究模型可用于研究cd19 car-t细胞在实体瘤中通过杀伤cd19+tams的治疗效果，提供了一种实体瘤car-t细胞治疗新方法，为cd19 car-t为cd19 car-t走入临床实体瘤应用提供研究基础。
1.一种cd19+tams靶向杀伤剂，其特征在于，所述cd19+tams靶向杀伤剂中含有cd19car-t细胞。
2.根据权利要求1所述的cd19+tams靶向杀伤剂，其特征在于，所述cd19+tams靶向杀伤剂通过静脉回输发挥作用。
3.根据权利要求1所述的cd19+tams靶向杀伤剂，其特征在于，所述cd19 car-t细胞通过逆转录病毒转染方法构建得到。
4.根据权利要求3所述的cd19+tams靶向杀伤剂，其特征在于，所述逆转录病毒转染方法具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的cd19+tams靶向杀伤剂，其特征在于，所述cd19 car序列中包括鼠cd8a信号肽、anti-mouse cd19 scfv、鼠cd8a铰链区和跨膜区、cd28信号和cd3ζ的包浆信号。
6.根据权利要求5所述的cd19+tams靶向杀伤剂，其特征在于，所述cd19 car的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7.权利要求1～6任一项所述的cd19+tams靶向杀伤剂在提升实体瘤患者免疫治疗疗效中的应用。
8.权利要求1～6任一项所述的cd19+tams靶向杀伤剂的应用，其特征在于，所述cd19+tams靶向杀伤剂以非治疗目的回输至富含cd19+tams的双侧皮下瘤小鼠模型中。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述富含cd19+tams的双侧皮下瘤小鼠模型通过包括以下步骤的构建方法得到：
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述cd19+巨噬细胞和cd19-巨噬细胞是通过流式分选脾脏组织单细胞悬液得到，再分别与肝癌细胞混合种植，形成皮下瘤。
