本发明涉及漆酶固定化，特别涉及一种基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶及其制备方法。
背景技术：
1、漆酶(ec 1.10.3.2)又称对二酚-二氧化还原酶，是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，最早由日本学者yoshida(1883)在紫胶漆树rhus vernicifera中发现。漆酶的底物广泛性、底物在自然界中的难降解性与毒性以及漆酶反应的环境友好性使得漆酶有着极大的应用前景。如今，漆酶已被广泛应用于纸浆造纸、污水处理、食品、有机合成等行业，此外漆酶在环境修复、服装行业、毒品检测和生物传感器方面也有相应的研究报道。通常，目前所有的漆酶应用原理都是利用漆酶的氧化还原特性氧化有毒的芳香族化合物。但是，由于游离漆酶的稳定性低、不可回收和高成本，这也大大限制了游离漆酶的实际中运用。
2、通过固定化酶技术，能够克服上述不足。将游离酶进行适当的固定化后，相比之下固定化酶的适应性增强，对环境的ph、温度耐受范围变宽，能够多次被循环利用，从而降低成本，此外可能还会赋予其特定的性能。但固定化载体的结构及性能对漆酶的酶活和酶学性质有着重要的影响。通常，固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶等材料，但是这些材料存在固定化效率低，不稳定等缺点。因而，急需寻找到一种更加高效、稳定的固定化载体及固定方法，这对扩大漆酶的实际运用具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶及其制备方法。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，包括以下步骤：
3、s1、从食用菌菌渣中提取漆酶；
4、s2、利用食用菌菌渣通过热解、研磨的方法制备纳米生物炭，然后在纳米生物炭表面修饰四氧化三铁，制备得到磁性纳米生物炭；
5、s3、将步骤s1制备的漆酶负载在步骤s2制备的磁性纳米生物炭上，得到磁性纳米生物炭固定化漆酶。
6、优选的是，步骤s1具体包括：
7、s1-1、提取粗酶：将食用菌菌渣粉碎后与生理盐水混合，抽提，离心，取上清液，得到粗酶液；
8、s1-2、制备漆酶溶液：将粗酶液采用(nh4)2so4进行分级沉淀，离心，取沉淀重于去离子水中，得到漆酶溶液；
9、s1-3、离子交换层析：将漆酶溶液透析脱盐，然后通过阴离子交换层析柱层析，得到活性组分1；
10、s1-4、凝胶过滤层析：将活性组分透析脱盐，冷冻干燥后溶解于去离子水中，再通过凝胶过滤层析，得到活性组分2，冷冻干燥后得到漆酶。
11、优选的是，步骤s1具体包括：
12、s1-1、提取粗酶：
13、将食用菌菌渣粉碎后与生理盐水混合，搅拌均匀，在2-10℃抽提4～8h，6000-24000rpm下离心2-10min，取上清液，得到粗酶液；
14、其中，食用菌菌渣的质量与生理盐水的体积比为1g：4～6ml；
15、s1-2、制备漆酶溶液：
16、向粗酶液中加入(nh4)2so4做一级沉淀，搅拌15-60min，5000-20000rpm下离心5-30min，弃沉淀，向所得的上清液中再加入(nh4)2so4做二级沉淀，搅拌15-60min，5000-20000rpm下离心5-30min，弃上清液，取沉淀重溶于去离子水中，得到漆酶溶液；
17、s1-3、离子交换层析：
18、将漆酶溶液加入截留分子量为20-40kda的透析袋中，在2-10℃下，用25-100倍于漆酶溶液体积的去离子水透析24-48h；取透析袋内溶液在deae-sepharose ff阴离子交换层析柱中利用ph值为7～9的nacl洗脱液洗脱不吸附组分，得到活性组分deae，即活性组分1；
19、s1-4、凝胶过滤层析：
20、将活性组分deae加入截留分子量为20-40kda的透析袋中，用25-100倍于活性组分deae体积的去离子水透析24-48h，取透析袋内溶液冷冻干燥，然后溶解于去离子水中，再通过sephadex g-100凝胶过滤层析，得到活性组分se，即活性组分2，冷冻干燥48～64h后得到漆酶。
21、优选的是，步骤s1-2中，一级沉淀采用的(nh4)2so4的饱和度为0.1％～60％，二级沉淀采用的(nh4)2so4的饱和度为40％～90％。
22、优选的是，步骤s2具体包括：
23、s2-1、将食用菌菌渣粉碎，干燥得到菌渣粉末；
24、s2-2、将干燥后的菌渣粉末进行热解，球磨，过筛，得到的生物炭粉末溶于去离子水中，超声分散均匀，离心，取上清液过滤，取滤渣，得到纳米生物炭；
25、s2-3、将纳米生物溶于去离子水中，加入铁浸渍溶液，再加入氨水将ph调至碱性，搅拌，用磁铁分离出磁性物质，用去离子水冲洗，得到磁性纳米生物炭。
26、优选的是，步骤s2具体包括：
27、s2-1、将食用菌菌渣粉碎，90～100℃下干燥48～64h，得到菌渣粉末；
28、s2-2、将干燥后的菌渣粉末以5～20℃·min-1的升温速率升温至600～800℃，热解1～2h，产物在300～500rpm下球磨1～2h，过50-150目筛，将得到的生物炭粉末溶于去离子水中，超声分散均匀，2500-10000rpm下离心1-6min，取上清液用0.1-0.3μm的滤膜过滤，取滤渣，得到纳米生物炭；
29、s2-3、将纳米生物溶于去离子水中，加入100～200ml铁浸渍溶液，再加入10～20ml浓度为6～8mol/l的氨水将ph调至碱性，60～80℃下搅拌1-4h，降至室温后用磁铁分离出磁性物质，用去离子水冲洗，得到磁性纳米生物炭；
30、其中，纳米生物炭与去离子水的质量体积比为4g：100～200ml；
31、其中，铁浸渍溶液为氯化铁和氯化亚铁的去离子水溶液，氯化铁和氯化亚铁的浓度依次为0.004-0.016mol/ml、0.002-0.008mol/ml。
32、优选的是，食用菌为平菇菌、香菇菌、草菇菌、蘑菇菌、木耳菌、银耳菌、猴头菌、竹荪菌、松口蘑菌、口蘑菌、红菇菌、灵芝菌、虫草菌、松露菌、白灵菇菌、牛肝菌、羊肚菌、马鞍菌中的任意一种或多种的混合物。
33、优选的是，步骤s3具体包括：
34、将步骤s1制备的漆酶和步骤s2制备的磁性纳米生物炭分散在ph为8.0的tris-hcl缓冲溶液中，在2-10℃下震荡混合24～48h，然后用磁铁行固液分离，所得磁性固体用tris-hcl缓冲溶液洗涤1-5次，得到固定化漆酶。
35、优选的是，所述固定化漆酶的固定化酶活力为0.02-0.2u/g，该固定化酶活力表示每1g固定化漆酶所具备的酶活力值。
36、本发明还提供一种磁性纳米生物炭固定化漆酶，其通过如上所述的方法制备得到。
37、本发明的有益效果是：
38、本发明提供了基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶及其制备方法，本发明制备的固定化漆酶固定化效率高、降解吸附作用强，并具有良好的耐热稳定性、耐酸碱稳定性和重复稳定性，可用于氧化酚类、抗生素和雌激素等新污染物的催化去除，具有很好的市场应用前景；
39、本发明的方法利用食用菌菌渣作为原料提取漆酶和制备磁性纳米生物炭材料，可实现菌渣资源化利用，能避免废弃菌渣处理不当导致的环境污染和资源浪费；
40、本发明的方法中利用球磨机球磨，使得生物炭能够达到纳米尺寸，且具备丰富的孔隙结构，使得生物炭的比表面积增大，进而能提高酶载量和酶的稳定性，长期维持酶的高活性；
41、本发明的方法中利用氯化铁和氯化亚铁溶液通过铁浸渍，使得磁性纳米生物炭表面生成四氧化三铁，可防止纳米颗粒团聚现象的发生，获得具有较好分散性的纳米颗粒；同时，磁化后的纳米生物炭固定化漆酶在降解完污染物后，能够利用外加磁场实现简单快速分离，实现漆酶重复利用的目标。
1.一种基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤s1具体包括：
3.根据权利要求2所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤s1具体包括：
4.根据权利要求3所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤s1-2中，一级沉淀采用的(nh4)2so4的饱和度为0.1％～60％，二级沉淀采用的(nh4)2so4的饱和度为40％～90％。
5.根据权利要求1所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤s2具体包括：
6.根据权利要求5所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤s2具体包括：
7.根据权利要求1所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，食用菌为平菇菌、香菇菌、草菇菌、蘑菇菌、木耳菌、银耳菌、猴头菌、竹荪菌、松口蘑菌、口蘑菌、红菇菌、灵芝菌、虫草菌、松露菌、白灵菇菌、牛肝菌、羊肚菌、马鞍菌中的任意一种或多种的混合物。
8.根据权利要求1所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，步骤s3具体包括：
9.根据权利要求8所述的基于食用菌菌渣制备磁性纳米生物炭固定化漆酶的方法，其特征在于，所述固定化漆酶的固定化酶活力为0.02-0.2u/g，该固定化酶活力表示每1g固定化漆酶所具备的酶活力值。
10.一种磁性纳米生物炭固定化漆酶，其特征在于，其通过如权利要求1-9中任意一项所述的方法制备得到。
