本发明涉及一种具有诱导软骨再生的磺化甜菜碱透明质酸微球及制备，属于生物医药。
背景技术：
1、关节软骨是由透明软骨、钙化软骨和软骨下骨组成，是一种特殊的承重组织，在膝关节、髋关节或肩关节处提供无摩擦运动，在关节活动中起重要作用。然而，关节软骨又是很容易受损的一种组织，在意外事故，或过度肥胖、关节炎、运动创伤等因素都可能给关节带来损害，即使是小面积的缺损也存在严重退变的潜在风险。由于骨软骨组织缺乏血管、神经和淋巴分布，导致增殖能力很弱，再生能力差，很难实现自身完全修复。而因受伤导致的软骨缺损愈合不良会导致严重的残疾和疼痛，并可能随着时间的推移发展成骨关节炎(oa)，使病情进一步恶化。因此，对于软骨修复与再生一直是临床上难以完全攻克的难题。
2、目前，软骨缺损的治疗方法主要包括保守治疗、手术修复和干细胞治疗。然而，这些方法存在一些局限性。保守治疗如药物和物理疗法通常仅能缓解症状，而无法实现软骨的真正再生。手术修复如微骨折手术、软骨移植和关节置换，虽然在一定程度上能缓解症状，但也存在诸多局限。例如，这些方法可能需要大范围手术，术后恢复周期长，且存在组织排异反应或手术失败的风险。干细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，具促进软骨再生有潜力但基于治疗关键之处仍存在许多问题，例如细胞分化方向不一、移植后再生能力下降。因此，开发一种安全、高效的软骨再生的治疗方案具有重要的研究意义和临床实用价值。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的目的是提供一种具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球的制备方法及其应用。
2、本发明所提供的具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球，其特征在于，设计与制备了两性离子磺酸化甜菜碱透明质酸sb-ha，并以此为载体材料，采用乳化法制备负载了生长因子bfgf的bfgf@sb-ha两性离子刷微球，具有诱导bmsc定向分化软骨功能，为临床上软骨修复提供可行的解决方案。
3、本发明提供一种具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)将磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物和乳化剂在盐溶液中混合搅拌，得到混合液；
5、(2)向步骤(1)得到的混合液中加入碱性成纤维细胞生长因子和油相，搅拌乳化再调节ph为9～10，然后加入交联剂，搅拌离心、洗涤、冷冻干燥，得到bfgf@sb-ha微球。
6、进一步的，步骤(1)中磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物是先合成磺基甜菜碱再接枝到透明质酸上，制备得到磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物；
7、或，先将甜菜碱接枝到透明质酸上再进行磺基化反应，制备得到磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物。
8、优选的，步骤(1)中磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物是先将甜菜碱接枝到透明质酸上再进行磺基化反应，制备得到磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物。
9、在本发明的一种实施例中，磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
10、s1：将透明质酸和/或透明质酸盐、n,n-二甲氨基丙胺溶解于溶媒i中，然后加入缩合剂、催化剂，于20～30℃下反应36～48h得到反应液i，之后将反应液i醇沉或膜分离，冷冻干燥得到中间体透明质酸-二甲氨基丙胺；
11、s2：将透明质酸-二甲氨基丙胺分散于有机溶剂ii中，加入1，3-丙磺酸内酯，于55～65℃下反应12～72h得到反应液ii，之后将反应液ii醇沉或膜分离，冷冻干燥得到磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物。
12、在本发明的一种实施例中，步骤s1中所述透明质酸盐包括透明质酸钠、透明质酸钾或透明质酸锌的一种或多种。
13、在本发明的一种实施例中，步骤s1中所述透明质酸和透明质酸盐的分子量为800～1000kda。
14、在本发明的一种实施例中，步骤s1中所述透明质酸和/或透明质酸盐的质量和n,n-二甲氨基丙胺的质量比为1:(1.1～1.2)。
15、在本发明的一种实施例中，步骤s1中所述溶媒i包括水、甲酰胺或dmso中的任意一种。
16、在本发明的一种实施例中，步骤s1中溶媒i的体积与透明质酸和/或透明质酸盐的质量之比为(10～15)ml:1g。
17、在本发明的一种实施例中，步骤s1中所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。
18、在本发明的一种实施例中，步骤s1中缩合剂用量为透明质酸和/或透明质酸盐质量的40～50％。
19、在本发明的一种实施例中，步骤s1中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
20、在本发明的一种实施例中，步骤s1中催化剂的用量为透明质酸和/或透明质酸盐质量的40～50％。
21、在本发明的一种实施例中，步骤s2中有机溶剂ii包括乙醇、甲酰胺或1，2-二氯乙烷中的任意一种。
22、在本发明的一种实施例中，步骤s2中有机溶剂ii的体积与透明质酸-二甲氨基丙胺的质量之比为(15～20)ml:1g。
23、在本发明的一种实施例中，步骤s2中1，3-丙磺酸内酯的用量与透明质酸-二甲氨基丙胺的质量比为1:(1.5～2)。
24、进一步的，步骤(1)中乳化剂包括tween-80和/或tween-40。
25、优选的，步骤(1)中乳化剂为tween-80。
26、进一步的，步骤(1)磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物和乳化剂的质量比为1:1.2～1.6。
27、进一步的，步骤(1)盐溶液的浓度为0.8～1.5m。
28、进一步的，步骤(1)磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量和盐溶液的体积之比为1g:100～200ml。
29、进一步的，步骤(2)中碱性成纤维细胞生长因子和磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量比为1:3.5～6.5。
30、进一步的，步骤(2)中油相为正庚烷、乙酸乙酯、硅油、环己烷、二氯甲烷中的一种或多种。
31、优选的，骤(2)中油相为正庚烷。
32、进一步的，步骤(2)中油相和磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量比为40～100:0.25～0.65。
33、进一步的，步骤(2)中交联剂为三偏磷酸钠交联剂。
34、进一步的，步骤(2)中交联剂和磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量比为1:25～35。
35、本发明提供根据上述方法制备得到的具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球。
36、本发明所提供的具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球在制备治疗关节炎、软骨再生、抗菌抗炎的生物材料，以及药物递送领域的应用。
37、本发明具有以下有益效果：
38、本发明提供了一种磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物，该透明质酸衍生物上的接枝度更高，具有更强的负电性和更高的亲和力，从而表现出良好的抗凝血性能、抗炎和生物相容性，进而使之成为良好的药物、生长因子等生物载体材料。
39、本发明具于磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物制备了一种透明质酸微球，该透明质酸微球是一种两性离子刷微球，兼有透明质酸和两性离子磺酸基甜菜碱(-n+(ch3)2-和so3-)特性，在形成微球时带电段暴露于微球外表，形成微球绒毛，进而使微球周围形成坚韧的水化层，呈现出卓越的润滑性能。当bfgf@sb-ha两性离子刷微球注射于骨关节部位，具有诱导bmsc定向分化软骨功能，成为临床上软骨再生的一种可行解决方案。
1.一种具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述透明质酸和/或透明质酸盐的质量和n,n-二甲氨基丙胺的质量比为1:(1.1～1.2)；步骤s1中溶媒i的体积与透明质酸和/或透明质酸盐的质量之比为(10～15)ml:1g。
4.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；缩合剂用量为透明质酸和/或透明质酸盐质量的40～50％；所述催化剂为4-二甲氨基吡啶；催化剂的用量为透明质酸和/或透明质酸盐质量的40～50％。
5.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于，步骤s2中，有机溶剂ii的体积与透明质酸-二甲氨基丙胺的质量之比为(15～20)ml:1g；1，3-丙磺酸内酯的用量与透明质酸-二甲氨基丙胺的质量比为1:(1.5～2)。
6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，乳化剂包括tween-80和/或tween-40；磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物和乳化剂的质量比为1:1.2～1.6；盐溶液的浓度为0.8～1.5m；磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量和盐溶液的体积之比为1g:100～200ml。
7.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤(2)中碱性成纤维细胞生长因子和磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量比为1:3.5～6.5。
8.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，油相为正庚烷、乙酸乙酯、硅油、环己烷、二氯甲烷中的一种或多种；油相和磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量比为40～100:0.25～0.65；交联剂为三偏磷酸钠交联剂；交联剂和磺酸化甜菜碱透明质酸衍生物的质量比为1:25～35。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球。
10.权利要求9中所述的具有诱导bmsc定向分化弹性软骨的磺酸化甜菜碱透明质酸微球在制备治疗关节炎、软骨再生、抗菌抗炎的生物材料，以及药物递送领域的应用。
