本发明属于生物医学新技术应用领域,具体涉及针对脑胶质瘤的靶向多肽及放射性示踪剂。
背景技术:
1、根据世界卫生组织(who)指南,脑肿瘤分为四个等级。多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,gbm)是级别最高的星形细胞肿瘤,患者的中位生存期不足15个月,5年生存率仅为5%。由于gbm侵袭性强,手术难以完全切除,放疗和化疗仍然是主要的治疗方法。然而,由于血脑屏障(blood-brain barrier,bbb)和血脑肿瘤屏障(blood-braintumor barrier,bbtb)的存在,大多数化疗药物很难到达肿瘤区域。因此,开发能够穿过bbb和bbtb的靶向诊断及治疗药物对于提高gmb患者生存率具有重要意义,也是当前领域研究的热点和难点所在。
2、发掘gbm特异性表达靶点,并筛选高亲和力配体是开发gmb靶向药物的前提条件。因此,迫切需要基于gbm特异性表达靶点的分子特性,寻找新的高亲和力配体,制备能够穿过bbb和bbtb的靶向分子探针。神经肽y(neuropeptide y,npy)是哺乳动物大脑中表达最丰富的神经肽,负责调节食欲、焦虑、昼夜节律、记忆和血压等多种生物学机制。npy的作用由y1r~6r的npy受体亚型介导,y1r和y2r在多种类型的人类肿瘤中上调,包括乳腺癌、肾上腺肿瘤、肾细胞癌、卵巢癌和胶质瘤。因此,y1r和y2r可以作为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。npy激活y1r促进肿瘤细胞增殖、血管生成和转移。与单克隆抗体等特异性配体相比,多肽具有分子量小、肿瘤摄取快以及正常组织清除快等优势。目前,已经有rgd等靶向多肽应用于脑胶质诊断,因此,针对npy1r开发靶向多肽,并应用于脑胶质瘤诊断和治疗具有重要的临床实用价值。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种与npy1r蛋白结合模式和亲和力更高的多肽配体,最终得到靶向npy1r蛋白的多肽序列。
2、本发明所提供的靶向npy1r蛋白的多肽,其氨基酸序列如下所示:kinwkfrlry,赖氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-酪氨酸,lys-ile-asn-trp-lys-phe-arg-leu-arg-tyr,缩写为kinw。
3、上述多肽kinw在制备诊断和治疗脑胶质瘤、乳腺癌和肺癌等肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
4、本发明的目的之二是提供一种基于上述多肽kinw的特异性靶向脑胶质瘤的放射性示踪剂。
5、所述脑胶质瘤具体可为多形性胶质母细胞瘤。
6、本发明设计并合成了一种对人脑胶质瘤细胞移植瘤具有特异靶向性的放射性示踪剂,探究了细胞实验和放射性核素68ga标记kinw对人脑胶质瘤细胞u87-mg细胞移植瘤的靶向作用,结果表明kinw对脑胶质瘤具有靶向作用,具有显像脑胶质瘤的潜在应用价值。
7、本发明所提供的放射性示踪剂,由以下组分组成:靶向npy1r蛋白的多肽kinw,螯合剂dota以及放射性核素68ga,其中,靶向npy1r蛋白的多肽kinw与螯合剂dota共价偶联,放射性核素68ga螯合到所述螯合剂dota上。
8、所述螯合剂dota的结构式如下所示:
9、
10、所述放射性示踪剂表示为:68ga-dota-kinw,其中,68ga为放射性核素,dota为螯合剂,kinw为靶向npy1r蛋白的多肽,其氨基酸序列如下所示:kinwkfrlry,赖氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸-酪氨酸,lys-ile-asn-trp-lys-phe-arg-leu-arg-tyr。
11、本发明的再一目的是提供上述放射性示踪剂的制备方法。
12、上述放射性示踪剂通过包括如下步骤的方法制备得到:
13、1)螯合剂-多肽的制备
14、在催化剂、缩合剂存在下,使螯合剂dota与多肽kinw进行偶联反应,得到螯合剂-多肽dota-kinw;
15、2)放射性核素标记螯合剂-多肽的制备
16、向螯合剂-多肽dota-kinw、水与氢离子缓冲剂的混合溶液中加入放射性核素68ga,反应得到放射性核素标记螯合剂-多肽,即放射性示踪剂68ga-dota-kinw。
17、上述方法步骤1)中,多肽与螯合剂、催化剂及缩合剂的摩尔比依次为1:1-5:1-5:1-5,具体可为1:3:3:3,
18、所述催化剂为有机碱,具体可为n-甲基吗啉;
19、所述缩合剂具体可为:hbtu;
20、所述偶联反应在惰性气氛中进行,所述惰性气氛为氮气气氛;
21、所述偶联反应的时间为5-15min,具体可为15min。
22、上述方法步骤2)中,所述氢离子缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸hepes,所述水与氢离子缓冲剂的混合溶液中hepes浓度为1m,ph为4-4.5;
23、所述螯合剂-多肽dota-kinw与放射性核素68ga的配比可为:0.1mg:2mci-0.2mg:2mci;
24、所述反应的温度可为80-100℃,时间可为15-30min,具体可为30min。
25、具体地,上述方法步骤2)的操作为:
26、将螯合剂-多肽dota-kinw溶解在超纯水,终浓度为1mg/ml,将100μl dota-kinw溶液与2mci68ga混合在2mlph=4.5的hepes缓冲液中,90℃反应30min,得到放射性示踪剂68ga-dota-kinw。
27、上述放射性示踪剂在制备肿瘤诊断试剂中的应用也属于本发明的保护范围。
28、所述应用中,所述肿瘤包括脑胶质瘤、乳腺癌和肺癌,更具体可为多形性胶质母细胞瘤。
29、所述诊断试剂用于人脑胶质瘤细胞和生物体内脑胶质细胞移植瘤的显像。
30、根据本发明的实施方案,所选人脑胶质瘤细胞为u87-mg细胞,所选生物体内人脑胶质细胞移植瘤为babl/c裸鼠原位移植瘤。
31、本发明提供的放射性示踪剂(具体为68ga-dota-kinw)与现有技术相比,具有以下有益效果:
32、1)本发明利用突变扫描和分子对接技术筛选改造的npy1r特异性结合的靶向多肽,与已有报道的序列相比,与npy1r的结合位点更多、细胞毒性小,人脑胶质瘤细胞对多肽的摄取作用更强;
33、2)本发明制备的放射性示踪剂作为人脑胶质瘤的显像药物能够穿过血脑屏障,具有显像时间长、容易制备等特点。
1.靶向npy1r蛋白的多肽,其氨基酸序列如下所示:
2.权利要求1所述的多肽在制备诊断和治疗肿瘤的产品中的应用。
3.一种放射性示踪剂,由以下组分组成:靶向npy1r蛋白的多肽,螯合剂dota以及放射性核素68ga,
4.制备权利要求4所述的放射性示踪剂的方法,包括如下步骤:
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,多肽与螯合剂、催化剂及缩合剂的摩尔比依次为1:1-5:1-5:1-5;
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,方法步骤2)中,所述氢离子缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸hepes,所述水与氢离子缓冲剂的混合溶液中hepes浓度为1m,ph为4-4.5;
7.权利要求3所述的放射性示踪剂在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肿瘤包括脑胶质瘤、乳腺癌和肺癌,更具体可为多形性胶质母细胞瘤。
9.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,所述诊断试剂用于人脑胶质瘤细胞和生物体内脑胶质细胞移植瘤的显像。