背景技术：
1、乙型病毒性肝炎(又称乙型肝炎或乙肝)是严重威胁全球、特别是中国的一类传染病，目前全球公认的两大类乙肝防止药物为干扰素和核苷类似物，但是这两类药物存在使用后容易产生耐药性或使用受限等多种弊端，如干扰素容易产生不良反应、核苷类药物存在耐药性和停药后复发问题。因此，若能从基因水平沉默病毒的基因表达，阻断hbv的生成和复制，由此从根本上降低病毒代谢和对肝细胞的侵染，无疑将是最为理想的乙肝治疗手段。小干扰rna(small interfering rna，sirna)可基于rna干扰(rna interference，rnai)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断任何感兴趣的目的基因(例如引发如癌症等疾病的基因)的表达，从而达到治疗疾病的目的。
2、sirna稳定化修饰及其递送系统是小rna药物开发中的两个关键技术。
技术实现思路
1、在一些实施方式中，本公开提供了一种sirna缀合物，该缀合物具有式(1)所示的结构：
2、
3、其中，
4、n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
5、m1、m2和m3独立地为选自2-10的整数；
6、r10、r11、r12、r13、r14和r15各自独立地为h，或选自于由以下基团所组成的组：c1-c10烷基、c1-c10卤代烷基以及c1-c10烷氧基；
7、r3为式a59所示结构的基团：
8、
9、其中，e1为oh、sh或bh2，nu为sirna；
10、所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述sirna含有正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列1与seq idno:155所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列2与seqid no:156所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
11、5'-ccuugaggcauacuucaaz-3'(seq id no:155)；
12、5'-z'uugaaguaugccucaagg-3'(seq id no:156)；
13、其中，z为a，z'为u，
14、所述核苷酸序列1中包含位置对应于z的核苷酸za，所述核苷酸序列2中包含位置对应于z'的核苷酸z'b，所述z'b是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；
15、r2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：c(o)、nh、o、s、ch＝n、s(o)2、c2-c10亚烯基、c2-c10亚炔基、c6-c10亚芳基、c3-c18亚杂环基和c5-c10亚杂芳基，并且其中，r2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：c1-c10烷基、c6-c10芳基、c5-c10杂芳基、c1-c10卤代烷基、-oc1-c10烷基、-oc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-oh、-oc1-c10卤代烷基、-sc1-c10烷基、-sc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-sh、-sc1-c10卤代烷基、卤素取代基、-oh、-sh、-nh2、-c1-c10烷基-nh2、-n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-nh(c1-c10烷基)、氰基、硝基、-co2h、-c(o)o(c1-c10烷基)、-con(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-conh(c1-c10烷基)、-conh2，-nhc(o)(c1-c10烷基)、-nhc(o)(苯基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(c1-c10烷基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(苯基)、-c(o)c1-c10烷基、-c(o)c1-c10烷基苯基、-c(o)c1-c10卤烷基、-oc(o)c1-c10烷基、-so2(c1-c10烷基)、-so2(苯基)、-so2(c1-c10卤代烷基)、-so2nh2、-so2nh(c1-c10烷基)、-so2nh(苯基)、-nhso2(c1-c10烷基)、-nhso2(苯基)和-nhso2(c1-c10卤代烷基)；
16、每个l1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：c(o)、nh、o、s、ch＝n、s(o)2、c2-c10亚烯基、c2-c10亚炔基、c6-c10亚芳基、c3-c18亚杂环基和c5-c10亚杂芳基，并且其中，l1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：c1-c10烷基、c6-c10芳基、c5-c10杂芳基、c1-c10卤代烷基、-oc1-c10烷基、-oc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-oh、-oc1-c10卤代烷基、-sc1-c10烷基、-sc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-sh、-sc1-c10卤代烷基、卤素取代基、-oh、-sh、-nh2、-c1-c10烷基-nh2、-n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-nh(c1-c10烷基)、氰基、硝基、-co2h、-c(o)o(c1-c10烷基)、-con(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-conh(c1-c10烷基)、-conh2，-nhc(o)(c1-c10烷基)、-nhc(o)(苯基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(c1-c10烷基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(苯基)、-c(o)c1-c10烷基、-c(o)c1-c10烷基苯基、-c(o)c1-c10卤烷基、-oc(o)c1-c10烷基、-so2(c1-c10烷基)、-so2(苯基)、-so2(c1-c10卤代烷基)、-so2nh2、-so2nh(c1-c10烷基)、-so2nh(苯基)、-nhso2(c1-c10烷基)、-nhso2(苯基)和-nhso2(c1-c10卤代烷基)；
17、表示基团连接至分子其余部分的位点；m1表示靶向基团。
18、在一些实施方式中，本公开提供了一种缀合物的制备方法，包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照sirna正义链和反义链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；分离出sirna的正义链和反义链，退火，其中，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述sirna含有正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列1与seq id no:155所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列2与seq id no:156所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
19、5'-ccuugaggcauacuucaaz-3'(seq id no:155)；
20、5'-z'uugaaguaugccucaagg-3'(seq id no:156)；
21、其中，z为a，z'为u，
22、所述核苷酸序列1中包含位置对应于z的核苷酸za，所述核苷酸序列2中包含位置对应于z'的核苷酸z'b，所述z'b是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；
23、并且，该方法还包括在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(321)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，从而使式(321)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。下文中，式(321)所示的化合物也称作缀合分子。
24、
25、其中：
26、r4为能够结合至nu代表的sirna的部分。在一些实施方式中，r4为能够通过共价键结合至nu代表的sirna的部分。在一些实施方式中，r4为能够经反应而通过磷酸二酯键缀合至nu代表的sirna的任意官能团的部分；
27、每个s1独立地是m1中全部活性羟基被ycoo-基团取代而形成的基团，其中，每个y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；
28、n1、n3、m1、m2、m3、r10、r11、r12、r13、r14、r15、l1、m1各自的定义和可选择的范围如前所述。
29、在一些实施方式中，本公开提供了一种能够抑制hbv基因表达的sirna，该sirna含有正义链和反义链，所述正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列i，所述反义链含有一段核苷酸序列ii，所述核苷酸序列ⅰ和所述核苷酸序列ⅱ至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列ⅰ含有核苷酸序列a，所述核苷酸序列a与seq id no:155所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ⅱ含有核苷酸序列b，所述核苷酸序列b与seq id no:156所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
30、5'-ccuugaggcauacuucaaz-3'(seq id no:155)；
31、5'-z'uugaaguaugccucaagg-3'(seq id no:156)，
32、其中，z为a，z'为u；
33、所述核苷酸序列a中包含位置对应于z的核苷酸za，所述核苷酸序列b中包含位置对应于z'的核苷酸z'b，所述z'b是所述反义链5'末端的第一个核苷酸，并且，
34、所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列a和核苷酸序列b中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
35、在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的sirna和药学上可接受的载体。
36、在一些实施方式中，本公开提供了一种sirna缀合物，所述sirna缀合物含有本公开提供的sirna以及缀合连接至该sirna的缀合基团，该sirna含有正义链和反义链，所述正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列i，所述反义链含有一段核苷酸序列ii，所述核苷酸序列ⅰ和所述核苷酸序列ⅱ至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列ⅰ含有核苷酸序列a，所述核苷酸序列a与seq id no:155所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ⅱ含有核苷酸序列b，所述核苷酸序列b与seq id no:156所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
37、5'-ccuugaggcauacuucaaz-3'(seq id no:155)；
38、5'-z'uugaaguaugccucaagg-3'(seq id no:156)，
39、其中，z为a，z'为u；
40、所述核苷酸序列a中包含位置对应于z的核苷酸za，所述核苷酸序列b中包含位置对应于z'的核苷酸z'b，所述z'b是所述反义链5'末端的第一个核苷酸，并且，
41、所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列a和核苷酸序列b中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
42、在一些实施方式中，本公开提供了本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物在制备用于治疗和/或预防由乙型肝炎病毒的感染引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
43、在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防由乙型肝炎病毒的感染引起的病理状况或疾病的方法，所述方法包括将有效量的本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物给予有需要的患者。
44、在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制hbv基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的修饰的sirna、药物组合物和/或sirna缀合物与所述感染乙型肝炎病毒的肝炎细胞进行接触。
45、在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物。
46、以引用的方式并入
47、本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利以及专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
1.一种sirna缀合物，该缀合物具有式(1)所示的结构：
2.根据权利要求1所述的sirna缀合物，其中，每个l1独立地选自式a1-a26基团中的一种或多种的连接组合：
3.根据权利要求1或2所述的sirna缀合物，其中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3；
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的sirna缀合物，其中，每个m1独立地为去唾液酸糖蛋白或糖；
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的sirna缀合物，其中，每个r10、r11、r12、r13、r14和r15独立地为h、甲基或乙基；
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的sirna缀合物，其中，该缀合物具有式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)或(22)所示的结构：
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的sirna缀合物，其中，式a59中的p连接到sirna正义链或反义链的端部，所述端部指所述正义链或反义链中从其一端起算的前4个核苷酸；
8.如权利要求1-7中任意一项所述的sirna缀合物，其中，所述核苷酸序列1与seq idno:155所示的核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与seq id no:156所示的核苷酸序列不多于1个核苷酸差异；
9.根据权利要求1-8所述的sirna缀合物，其中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度各自为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；
10.根据权利要求1-9所述的sirna缀合物，其中，所述sirna还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的sirna缀合物，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
12.根据权利要求11所述的sirna缀合物，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(101)所示结构的硫代磷酸酯基：
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的sirna缀合物，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸；
14.权利要求1-13中任意一项所述的sirna缀合物在制备用于治疗和/或预防由乙型肝炎病毒的感染引起的病理状况或疾病的药物中的用途；
15.一种在体外抑制乙型肝炎病毒基因表达的方法，其中，所述方法包括将有效量的权利要求1-13中任意一项所述的sirna缀合物与所述感染乙型肝炎病毒的肝炎细胞进行接触。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含利要求权利要求1-13中任意一项所述的sirna缀合物。
