本发明属于生物，具体涉及同时进行基因敲除和精准编辑的基因编辑方法。
背景技术：
1、通过基因编辑技术同时对多个目标性状进行修改能够快速实现分子设计育种。目前，应用最为广泛的基因编辑工具是crispr/cas9系统，主要由核酸内切酶cas9和sgrna组成。sgrna是一个人工设计的rna分子，包含了与目标dna序列相对应的crispr序列，会引导cas9酶前往特定的基因组位置，确保cas9在正确的地方进行dna切割，产生dna双链断裂(double strandbreak,dsb)。随后，细胞主要通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)修复dsb，导致基因序列变化。由于nhej修复介导的碱基插入缺失存在一定的随机性，往往破坏目标基因，难以实现精确的基因组编辑。借助于同源介导修复(homology-directed repair，hdr)机制，crispr-cas9系统可在外源dna供体(donor)的指导下实现精准的碱基替换或片段插入缺失。但是在植物细胞中，由于重组频率偏低和dnadonor的递送困难，crispr介导的hdr效率显著受限，往往难以高效的实现基因组精确编辑。
2、2019年底，美国哈佛大学david liu研究组开发了精确编辑技术——引导编辑(prime editing，pe)系统，并在随后的几年进行了优化，以提高精准编辑的效率。该系统是在crispr/cas9系统基础上改造而来，由ncas9-rt与epegrna两部分组成：ncas9-rt是只切割双链dna中的一条链的ncas9(h840a)和工程化改造m-mlv rt反转录酶(moloney murineleukemia virus reverse transcriptase)融合而成的蛋白；epegrna由以下部分组成，包括single-guide rna(sgrna)、引物结合位点(prime bindingsite，pbs)、储存有靶向位点编辑信息的反转录模板(rt template)以及增加整个rna稳定性的evopreq1结构。由epegrna中sgrna部分引导在基因组靶位置附近形成编辑链上的单链切口，进而通过epegrna中的pbs序列引导以含有目标编辑序列的逆转录模板将反转录模板上的突变精确导入基因组中，实现了目标位点的精准编辑。精准编辑工具pe拥有精准实现碱基替换和精准小片段插入缺失的能力，能够实现基因功能获得型的改造，其功能比经典的crispr/cas9技术只能形成随机的小片段插入缺失来得强。
3、多个理想性状基因的聚合是分子设计育种重要手段。目前crispr/cas9实现了高效的多基因同时敲除，但无法完成精准编辑。pe系统作为最新的精准编辑工具，能够实现任意碱基替换和精准的小片段插入和缺失，但通过pe系统来实现基因敲除需要进行复杂的epegrna的设计，同时pe系统实现多个epegrna的编辑效率较低。因此同时进行基因敲除和精准编辑的育种方法欠缺。
技术实现思路
1、本发明通过对pe系统进行优化，使其具备同时进行精准编辑和基因敲除的能力，进而开发了一种同时进行基因敲除和精准编辑的基因编辑方法。
2、本发明通过将pe系统组分ncas9-rt替换为cas9-rt，发现cas9-rt与epegrna组合仍可完成高效精准编辑，与此同时cas9-rt也可直接与sgrna组合完成基因敲除，而不需要进行复杂的epegrna设计。综上，本发明开发了一种同时进行基因敲除和精准编辑的基因编辑方法。
3、本发明首先提供一种用于基因编辑的cas9-rt融合蛋白，其由活性cas9蛋白、病毒核衣壳蛋白nc和删除逆转录酶mmlv的rnase h结构域rt组成。
4、进而本发明提供所述的cas9-rt融合蛋白的编码基因。
5、本发明还提供一种用于基因编辑的系统，其包括所述的cas9-rt融合蛋白和sgrna；或者包括所述的cas9-rt融合蛋白和epegrna；或者包括所述的cas9-rt融合蛋白、sgrna以及epegrna；
6、其中，所述epegrna由sgrna、引物结合位点pbs、逆转录模版rtt和rna基序evopreq1组成。
7、本发明进而提供一种用于基因编辑的载体，其包含有cas9-rt融合蛋白表达元件，靶标基因对应的sgrna表达元件的表达载体；或者是包含有cas9-rt融合蛋白表达元件和靶标基因对应的epegrna的表达元件的表达载体；或者是包含有cas9-rt融合蛋白表达元件，靶标基因对应的sgrna表达元件和靶标基因对应的epegrna的表达元件的表达载体。
8、优选地，所述载体为双元表达载体，所述cas9-rt融合蛋白表达元件含有水稻ubi启动子驱动表达cas9-rt融合蛋白，以及camv终止子；所述靶标基因对应的sgrna表达元件包含以水稻u3启动子驱动表达sgrna，以及poly-t尾巴；所述靶标基因对应的epegrna的表达元件含有以水稻u3启动子驱动表达epegrna，以及poly-t尾巴；
9、任选地，包括多个靶标基因对应的sgrna表达元件、靶标基因对应的epegrna的表达元件，其利用同尾酶连接的方式将其聚合至所述双元表达载体。
10、本发明还提供所述的cas9-rt融合蛋白、所述的编码基因、所述的基因编辑的系统或所述的载体系统在对植物进行基因敲除和/或基因编辑中的应用。
11、本发明进一步提供所述的cas9-rt融合蛋白、所述的编码基因、所述的基因编辑的系统或所述的载体系统在植物育种中的应用。
12、本发明也提供一种基因敲除的方法，其包括如下步骤：将所述的cas9-rt融合蛋白与针对目靶标基因相应的sgrna组合形成crispr/cas9系统，转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的敲除。所述针对目靶标基因相应的sgrna是一个或多个，例如两个，三个，四个，五个，六个。
13、具体地，将含有cas9-rt融合蛋白表达元件，靶标基因对应的sgrna表达元件的表达载体转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的基因敲除。
14、本发明还提供一种基因精准编辑的方法，其包括如下步骤：将所述的cas9-rt融合蛋白与针对靶标基因的epegrna组合形成引导编辑系统，转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的精准编辑。所述针对目靶标基因相应的epegrna是一个或多个，例如两个，三个，四个，五个，六个。
15、具体地，将含有cas9-rt融合蛋白表达元件和靶标基因对应的epegrna的表达元件的表达载体转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的精准编辑。
16、本发明尤其提供一种同时进行基因敲除和精准编辑的方法，其包括如下步骤：将所述的cas9-rt融合蛋白、针对目靶标基因相应的sgrna、针对靶标基因的epegrna共组合，共同转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的基因敲除和精准编辑。
17、优选地，将含有cas9-rt融合蛋白表达元件，靶标基因对应的sgrna表达元件和靶标基因对应的epegrna的表达元件的表达载体转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的基因敲除和精准编辑。
18、所述针对目靶标基因相应的sgrna和/或靶标基因对应的epegrna分别是一个或多个，例如两个，三个，四个，五个，六个。
19、crispr/cas9实现了高效的多基因同时敲除，但无法完成精准编辑。最新的pe系统，实现了高效的精准编辑，但通过pe系统同时实现多基因的精准编辑和敲除存在效率低且载体构建复杂的问题。现有技术中主要考虑用单碱基编辑系统来完成基因定点编辑，用别的crispr系统(如cas12a)来完成基因敲除，如论文(huang,x.,jia,h.,xu,j.,wang,y.,wen,j.,and wang,n.(2023).transgene-free genome editing of vegetativelypropagated and perennial plant species in the t0 generation via a co-editingstrategy.nature plants 9,1591-1597.)用单碱基系统cbe来完成als基因的单碱基编辑，同时用cas12a来完成对基因的敲除。而本发明将pe系统的组分之一ncas9-rt替换为cas9-rt，发现cas9-rt与epegrna组合可完全高效精准编辑，cas9-rt也可直接与sgrna组合完成基因敲除，而不需要进行复杂的epegrna的设计，且本发明也可以开发同时进行基因敲除和精准编辑的基因编辑方法。
1.一种用于基因编辑的cas9-rt融合蛋白，其特征在于，其由活性cas9蛋白、病毒核衣壳蛋白nc和删除逆转录酶mmlv的rnase h结构域rt组成。
2.如权利要求1所述的cas9-rt融合蛋白的编码基因。
3.一种用于基因编辑的系统，其特征在于，其包括如权利要求1所述的cas9-rt融合蛋白和sgrna；
4.一种用于基因编辑的载体，其特征在于，
5.如权利要求1所述的cas9-rt融合蛋白、如权利要求2所述的编码基因、如权利要求3所述的基因编辑的系统或如权利要求4所述的载体系统在对植物进行基因敲除和/或基因编辑中的应用。
6.如权利要求1所述的cas9-rt融合蛋白、如权利要求2所述的编码基因、如权利要求3所述的基因编辑的系统或如权利要求4所述的载体系统在植物育种中的应用。
7.一种基因敲除的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.一种基因精准编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.一种同时进行基因敲除和精准编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将含有cas9-rt融合蛋白表达元件，靶标基因对应的sgrna表达元件和靶标基因对应的epegrna的表达元件的表达载体转化目标植物，以完成对目标植物中靶标基因的基因敲除和精准编辑；
