本发明涉及生物工程，具体涉及一种生产双链rna的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
背景技术：
1、rna干扰(rnai)是由基因特异性外源双链rna(dsrna)引发的生物体中特定基因的靶向下调。自发现以来，rnai已成功应用于介导许多昆虫物种的基因敲低。此外，dsrna的长度被发现对rnai反应的功效有显着影响；通常较高浓度的dsrna诱导rnai更有效。但是，化学合成dsrna的高生产成本极大地阻碍了基于rnai的害虫防治技术的发展。所以，基于细菌的dsrna表达具有降低dsrna大规模生产成本的巨大潜力。然而，现在广泛应用的l4440-ht115(de3)系统中dsrna的生产效率仍需提高，以满足dsrna的现场应用。
2、越来越多的证据证实了脂肪酸是细菌的重要资源，脂肪酸不再仅仅是用于β-氧化的碳源；它们代表了具有营养价值、膜磷脂重塑和信号介导的行为控制的多用途分子。细菌对外源脂肪酸的利用与许多细胞过程有关，包括脂肪酸氧化以获得代谢增益、同化为膜磷脂以及与毒力相关的表型的控制。所以，引入脂肪酸可能是提高细菌的dsrna表达的一种策略。
技术实现思路
1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产双链rna的重组大肠杆菌及其应用。
2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种生产双链rna的重组大肠杆菌及其应用。基于rnai效率对高浓度dsrna的需求，本发明提供了一种提高双链rna产量的方法。本发明采用的技术方案如下：
3、第一方面，本发明提供了一种生产双链rna的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为敲除了rnc和minc基因同时导入了rnai重组表达载体的大肠杆菌。所述rnc基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述minc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、其中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)，即重组大肠杆菌的出发菌株。
5、其中，所述的rnai重组表达载体，包括质粒载体、目的基因片段、loop序列和目的基因反向互补片段。
6、其中，所述的质粒载体为含有单个t7启动子的质粒载体，优选为pbbe1a、pet28a或petduet中的任意一种。更优选pet28a。
7、其中，所述的目的基因片段长度为200～800bp；所述的loop序列为不与目的基因互补配对的序列，长度为100～200bp；优选地，所述的目的基因片段为来源于灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)的egr基因片段；所述的目的基因片段、loop序列和目的基因反向互补片段如seq id no.9所示。
8、其中，作为能够敲除上述基因的宿主微生物，只要是能够应用基因重组技术的微生物，便无特别的限定。作为具体例子，可以举出大肠杆菌、酵母、棒状杆菌、或梭菌属细菌。其中，使用大肠杆菌、酿酒酵母或谷氨酸棒杆菌容易进行敲除，因此优选使用大肠杆菌bl21de3。
9、第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
10、(1)以大肠杆菌为出发菌株，敲除rnc基因和minc基因，得到底盘菌株；
11、(2)构建rnai重组表达载体；
12、(3)在步骤(1)得到的底盘菌株中导入步骤(2)构建得到的rnai重组表达载体，即得。
13、其中，具体包括如下步骤：
14、(1)以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株，利用peccas9/ptargetf技术先后敲除rnc基因和minc基因，得到底盘菌株bl21(de3)△rnc△minc；所述的底盘菌株为能够高效生产双链rna并能与rnai重组表达载体相匹配的底盘。
15、(2)将目的基因片段、loop序列和目的基因反向互补片段通过overlap pcr依次连接，并克隆至质粒载体中，得到rnai重组表达载体；
16、(3)在所述的底盘菌株中导入所述的rnai重组表达载体，即得。
17、其中，步骤(1)中，所述的利用peccas9/ptargetf技术先后敲除rnc基因和minc基因的方法包括如下步骤：
18、s1、制作含有peccas9质粒的bl21(de3)菌株的感受态；
19、s2、选取待敲除基因rnc和minc两端基因作为上下同源臂构建donor dna-minc和donor dna-rnc；
20、s3、根据待敲除基因minc和rnc的n20序列构建质粒ptargetf-minc和ptargetf-rnc；
21、s4、将donor dna-rnc和ptargetf-rnc质粒共转入含有peccas9的大肠杆菌bl21(de3)感受态中，涂布于对应抗生素抗性的lb平板并进行过夜培养；
22、s5、平板上挑取单菌落，进行菌落pcr验证，若敲除成功，则应出现donor dna-rnc大小的条带。
23、s6、对验证成功敲除rnc的菌落进行二代基因敲除技术质粒丢失：将阳性克隆子接lb液体(kan抗性)，加入10mm的鼠李糖诱导8h，然后lb+蔗糖(蔗糖浓度为10g/l)平板划线，37℃培养过夜，挑单克隆分别到lb/lb+kan/lb+spec平板37℃培养，在lb平板上生长，在lb+kan和lb+spec不生长的即为双质粒丢除菌株，即bl21(de3)△rnc。
24、s7、将donor dna-minc和ptargetf-minc质粒共转入含有peccas9的大肠杆菌bl21(de3)△rnc感受态中，涂布于对应抗生素抗性的lb平板并进行过夜培养；
25、s8、平板上挑取单菌落，进行菌落pcr验证，若敲除成功，则应出现donor dna-minc大小的条带。
26、s9、对验证成功敲除minc的菌落进行二代基因敲除技术质粒丢失：将阳性克隆子接lb液体(kan抗性)，加入10mm的鼠李糖诱导8h，然后lb+蔗糖(蔗糖浓度为10g/l)平板划线，37℃培养过夜，挑单克隆分别到lb/lb+kan/lb+spec平板37℃培养，在lb平板上生长，在lb+kan和lb+spec不生长的即为双质粒丢除菌株，即bl21(de3)△rnc△minc。
27、其中，步骤(2)中，所述的rnai重组表达载体的构建方法为：选择灰葡萄孢菌麦角甾醇生物合成途径中的egr基因为目的基因，选取目的基因片段，目的基因反向互补片段命名为egr(互补)，并且引入一个用于形成茎环结构的基因序列，命名为loop。将这三段序列以egr-loop-egr(互补)的次序被组装到质粒载体上。
28、第三方面，本发明提供了第一方面所述的重组大肠杆菌在发酵生产双链rna中的应用。即将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，20～40℃发酵培养2～24h。优选地，将所述的重组大肠杆菌体积比1:50-100的接种量接种至发酵培养基，37℃发酵培养2～24h。
29、其中，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨5～15g/l，酵母粉提取物2～10g/l，无机盐5～15g/l和脂肪酸10～500μm。优选地，所述的无机盐为nacl；更优选地，胰蛋白胨10g/l，酵母粉提取物5g/l，nacl 10g/l和脂肪酸10μm。
30、其中，所述的脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、9-十六碳烯酸或顺式-10-十九碳烯酸中的任意一种或多种的组合。优选地，所述的脂肪酸为亚麻酸、花生四烯酸、9-十六碳烯酸和顺式-10-十九碳烯酸。更优选地，所述的脂肪酸为顺式-10-十九碳烯酸。
31、其中，在发酵至od600为0.1～1.0时添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，优选发酵至od600为0.4时添加iptg。所述iptg的添加浓度为0.01～2.0mm，优选0.4～0.6mm；更优选0.4mm。所述的诱导时间为2～18h，优选4h。
32、优选地，提取双链rna的方法为：将25ml细胞培养物以10000g离心5min，得沉淀1；将沉淀1重悬于25mlpbs(ph＝7.2)配制的75％无水乙醇中，室温下孵育5min，并将细胞悬浮液以10000g离心5min，得沉淀2；将沉淀2重悬于2500μl浓度为150mm nacl中，98℃孵育10min后，13000g离心10min以获得粗提的dsrna；向200μl粗提的dsrna添加4μl rnase freednase1(1u/μl，购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、26μl 10×dnase reactionbuffer(购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)和4μlrnase a(100ng/μl，购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、26μl的3m nacl；将混合物在37℃下孵育1h以破坏剩余的dna和单链rna；加入260μl苯酚/氯仿/异戊醇通过剧烈涡旋分离dsrna，然后在室温下以12000g离心15min；将含有dsrna的上相转移到新管中，并通过涡旋与100μl nh4oac醋酸铵(7.5m)和100μl异丙醇混合，在4℃下以12000g离心30min；弃去上清液并使用500μl乙醇(70％)仔细洗涤dsrna沉淀两次；dsrna在无菌通风橱中风干5-10min，然后重悬于100μl预热的无核酸酶水中；使用nanodrop 2000分光光度计对纯化的dsrna进行定量，并通过2％琼脂糖凝胶电泳和紫外光下可视化来评估dsrna的完整性。
33、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
34、(1)本发明通过熟练运用分子生物学相关理论和peccas9/ptargetf基因编辑技术，敲除了大肠杆菌bl21(de3)的minc和rnc基因并将其与单个t7启动子的rnai重组表达载体相匹配，大幅度提高了dsrna产量，优于已知的l4440-ht115大肠杆菌表达系统。同时又优化了培养条件和培养基，通过在培养基中外源加入了脂肪酸进行发酵，进一步提高了dsrna产量，可达到23.75μg/ml，相比现有的l4440-ht115大肠杆菌表达系统，产量提高了3.4倍。
35、(2)本发明利用的大肠杆菌bl21(de3)△rnc△minc衍生的无核小细胞可以用作dsrna生产和封装的经济高效、可扩展的平台。而且，小细胞封装的dsrna不受rnase降解的影响，并在农作物表面稳定，更好的满足了田间rnai制剂应用的需要。
1.一种生产双链rna的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为敲除了rnc基因和minc基因同时导入了rnai重组表达载体的大肠杆菌；所述rnc基因的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述minc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21de3。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的rnai重组表达载体，包括质粒载体、目的基因片段、loop序列和目的基因反向互补片段。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的质粒载体为含有单个t7启动子的质粒载体，优选为pbbe1a、pet28a或petduet中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的目的基因片段长度为200～800bp；所述的loop序列为不与目的基因互补配对的序列，长度为100～200bp；优选地，所述的目的基因片段为来源于灰葡萄孢菌botrytis cinerea的egr基因片段；所述的目的基因片段、loop序列和目的基因反向互补片段的核苷酸序列如seq id no.9所示。
6.权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.权利要求1-5中任意一项所述的重组大肠杆菌在发酵生产双链rna中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，20～40℃发酵培养2～24h。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨5～15g/l，酵母粉提取物2～10g/l，无机盐5～15g/l和脂肪酸10～500μm。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、9-十六碳烯酸或顺式-10-十九碳烯酸中的任意一种或多种的组合。
12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在发酵至od600为0.1～1.0时添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷进行诱导，所述异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的添加浓度为0.01～2.0mm，优选0.4～0.6mm。
