本发明涉及蛋白质工程，特别涉及一种基于高斯荧光素酶的报告蛋白。
背景技术：
1、荧光素酶介导的生物发光成像已成为监测不同领域体外和体内各种生物过程的报告工具，包括免疫学，肿瘤学，病毒学和神经科学。所有已知的荧光素酶通常存在于低等生物中，例如细菌，真菌，昆虫和海洋甲壳类动物。迄今为止，所有已知的荧光素酶氧化时发射光子，它们在组内或组之间序列不具有同源性，并且可以使用不同的底物。
2、gaussia luciferase(gluc):高斯荧光素酶是生活在海底350～1000m深处的桡足类动物g.princeps体内分泌出来的一种发光物质。最初的研究发现g.princeps通过快速游动瞬间释放刺眼的荧光是为了躲避捕食者的追捕，同时g.princeps通过控制发光腺体来控制发光强度与释放的光子数。该现象引起了科学家的兴趣，随后进行了一系列研究，但直到1999年bryan等才从大肠杆菌菌株中首次克隆表达并分离出gluc。
3、gluc是目前已知的可自然分泌的最小荧光素酶，是具有185个氨基酸的单体蛋白。虽然到目前为止gluc的结构还不很清楚，但有研究发现gluc初级结构中的27～97及98～168残基组成的2个结构域中有71个残基的重复序列，通过化学修饰法发现其中的4个保守的半胱氨酸残基中的二硫键是gluc分泌到细胞外且具有较高灵敏度的必需结构，但不是发生荧光反应的必需结构。
4、由于gaussia荧光素酶基因具有由16个氨基酸组成的分泌信号，因此它在哺乳动物细胞中表达后以活性形式自然分泌。与renilla荧光素酶类似，不需要任何辅助因子，并且在反应中催化底物腔肠素的氧化，导致在480nm的峰值处发射蓝光。这种分泌型的荧光素酶，可以检测培养物的上清中和动物血液或尿液进行检测，增加的更多的检测手段。有文献报道，与常用的firefly荧光素酶和renilla荧光素酶相比，gaussia荧光素酶在活体培养细胞中产生的生物发光信号强度提高了1000倍以上，体内信号强度也提高了200倍。
5、在全部双链rna病毒以及部分dna病毒复制增殖过程中，均需要有自裂解蛋白酶的帮助。例如：人类免疫缺陷病毒(hiv，human immunodeficiency virus)自裂解蛋白酶能够将hiv的gag基因和gag-pol基因表达的多聚蛋白裂解成病毒需要的蛋白。hiv蛋白酶在hiv病毒的成熟与复制过程中起到非常关键的作用，抑制该酶会产生无感染力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染；又如，新冠病毒的多聚蛋白由3clpro蛋白酶进行裂解，其中3clpro由于它的切割特异性很强，可避免脱靶的可能，被广泛认为可作为优秀的药物靶点。因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性以及相关蛋白酶抑制剂活性筛选平台十分必要。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于高斯荧光素酶的报告蛋白，通过在高斯荧光素酶的特定位置插入能被病毒蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，仍然具有高斯荧光素酶发光功能，从而形成一种全新的报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被病毒蛋白酶识别并裂解后，报告蛋白分成两部分丧失功能，此时高斯荧光素酶失去活性，表现为检测的发光强度明显降低，当病毒蛋白酶被抑制时报告蛋白能够正常发光，基于此可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价、抗病毒药物的筛选等。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种基于高斯荧光素酶的报告蛋白，所述报告蛋白是在高斯荧光素酶的特定位点插入外源氨基酸序列后，仍然具有高斯荧光素酶发光功能的融合蛋白；
4、所述特定位点为高斯荧光素酶氨基酸序列上k18-g49氨基酸区域中任意两个相邻氨基酸之间构成的插入位点，k18-g49氨基酸区域的序列为kptennedfnivavasnfattdldadrgklpg(seq id no.1)；
5、或所述特定位点为高斯荧光素酶氨基酸序列上i12与a13之间构成的插入位点；
6、或所述特定位点为高斯荧光素酶氨基酸序列上g174与q175之间构成的插入位点。
7、由于gluc酶活与其三级结构密切相关，在插入蛋白酶的裂解位点后很有可能使改造后的gluc失去活性，本发明经过研究，意外的发现，在高斯荧光素酶的某些特定位置(如第18-第49位氨基酸区域)插入特定长度的氨基酸序列后，高斯荧光素酶仍能维持原有发光功能，本发明的这种改造的插入位点在高斯荧光素酶序列内部，当插入序列受到破坏时，高斯荧光素酶的结构同时被破坏，导致发光强度明显降低。这样的发现能够给高斯荧光素酶带来全新的应用，比如与病毒成熟与复制相关的蛋白酶，该类蛋白酶可以作为抗病毒药物的靶点，那么通过本发明的基于高斯荧光素酶的报告蛋白则可以为筛选全新的抗病毒药物服务，当蛋白酶正常发挥功能时改造后的高斯荧光素酶(即报告蛋白)被切割成两部分丧失功能，此时发光强度明显降低；当蛋白酶被抑制时改造后的高斯荧光素酶能够正常发出荧光，根据改造后的高斯荧光素酶的荧光强度还能正向反映蛋白酶抑制剂的抑制效果。这一系列操作均可以在细胞水平进行，可以完全模拟候选药物在细胞内发挥作用的全过程，而现有的抗病毒药物筛选方法由于是在非细胞水平进行操作，缺失了候选药物进入细胞的过程，很容易造成候选药物的漏筛和误筛，且需要体外表达蛋白酶，耗时耗力，本发明的报告蛋白应用后则能完全克服现有方法的缺点，可以简便、高通量的进行蛋白酶抑制剂类抗病毒候选药物筛选。
8、所述外源氨基酸序列为能被病毒蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列。
9、作为优选，所述外源氨基酸序列长度为3-12个氨基酸。
10、作为优选的实施方式，能被病毒蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列选自seq idno.2-seq id no.8所示序列中的一种。
11、所述病毒蛋白酶来自小核糖核酸病毒科病毒、杯状病毒科病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、光装病毒科病毒、呼肠孤病毒科病毒、双节段rna病毒科病毒、弹状病毒科病毒、正粘病毒科病毒、纤丝病毒科病毒、副粘病毒科病毒、布尼亚病毒科病毒、沙粒病毒科病毒、逆转录病毒科病毒中的一种。
12、作为优选，所述病毒蛋白酶选自以下之一：
13、与新型冠状病毒复制相关的蛋白酶(如3clpro)、与艾滋病病毒(hiv)复制相关的蛋白酶、与登革热病毒(dv)复制相关的蛋白酶(ns2b/ns3)、与丙型肝炎病毒(hcv)复制相关的蛋白酶(ns3/4a)，、与手足口病病毒(ev71)复制相关的蛋白酶(3c)、与非洲猪瘟病毒(asfv)复制相关的蛋白酶(s273r)、与猫冠状病毒(fcov)复制相关的蛋白酶(3cl)。
14、作为优选，所述报告蛋白相对于高斯荧光素酶的荧光信号值保留程度大于1％，且报告蛋白的荧光信号值比阴性对照的荧光信号值大至少两个数量级。
15、荧光信号值保留程度的计算公式为：(基于高斯荧光素酶的报告蛋白组荧光信号平均值-阴性对照组荧光信号平均值)/(高斯荧光素酶组荧光信号平均值-阴性对照组荧光信号平均值)*100％，以空质粒载体为阴性对照。
16、一种核苷酸，其编码所述的报告蛋白。
17、一种质粒，其包括所述的核苷酸。
18、作为优选，还包括病毒蛋白酶的编码核苷酸序列，所述质粒共表达基于高斯荧光素酶的报告蛋白和病毒蛋白酶。
19、一种以病毒蛋白酶为靶点的蛋白酶抑制剂抗病毒候选药物筛选方法，包括以下步骤：
20、(1)构建共表达所述的基于高斯荧光素酶的报告蛋白和病毒蛋白酶的共表达质粒；
21、(2)筛选：细胞铺多孔板后，将共表达质粒转染细胞，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加待筛选候选药物，并设阴性对照，观察细胞状态，培养后检测基于高斯荧光素酶的报告蛋白的荧光信号值；若与对照组相比荧光信号值增加，则表示候选药物对病毒蛋白酶具有抑制效果，荧光信号值增加越多则代表候选药物对病毒蛋白酶的抑制效果越强。
22、一种病毒蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，包括以下步骤：
23、(1)构建共表达所述的基于高斯荧光素酶的报告蛋白和病毒蛋白酶的共表达质粒；
24、(2)评价：将细胞铺于细胞培养皿中，加入共表达质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加病毒蛋白酶抑制剂，以不添加病毒蛋白酶抑制剂的细胞为阴性对照，以转染单独表达基于高斯荧光素酶的报告蛋白质粒为阳性对照，观察细胞状态，培养后检测荧光信号值；实验组荧光信号均值>阴性对照组荧光信号均值，并且≤阳性对照组荧光信号均值，说明实验可信，在此基础上，实验组荧光信号值正向反映抑制剂的抑制效果，荧光信号值越高则代表抑制剂对病毒蛋白酶的抑制效果越强。
25、本发明的有益效果是：
26、1、本发明基于改造的高斯荧光素酶，可以蛋白酶为靶点进行抗病毒药物筛选，抗病毒药物对蛋白酶的抑制效果与荧光信号值呈正相关，可定量分析抑制效果。
27、2、本发明抗病毒药物筛选方法和蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，能够避免使用活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，具有高效、准确、稳定、高通量、可重复的优点。
1.一种基于高斯荧光素酶的报告蛋白，其特征在于：所述报告蛋白是在高斯荧光素酶的特定位点插入外源氨基酸序列后，仍然具有高斯荧光素酶发光功能的融合蛋白；
2.根据权利要求1所述的报告蛋白，其特征在于：所述外源氨基酸序列为能被病毒蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的报告蛋白，其特征在于，能被病毒蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列选自seq id no.2-seq id no.8所示序列中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的报告蛋白，其特征在于：所述外源氨基酸序列长度为3-12个氨基酸。
5.根据权利要求2所述的报告蛋白，其特征在于，所述病毒蛋白酶选自以下之一：
6.根据权利要求1所述的报告蛋白，其特征在于：所述报告蛋白相对于高斯荧光素酶的荧光信号值保留程度大于1％，且报告蛋白的荧光信号值比阴性对照的荧光信号值大至少两个数量级。
7.一种核苷酸，其特征在于：其编码如权利要求1-6中任一项所述的报告蛋白。
8.一种质粒，其特征在于，其包括如权利要求7中所述的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的质粒，其特征在于，还包括病毒蛋白酶的编码核苷酸序列，所述质粒共表达基于高斯荧光素酶的报告蛋白和病毒蛋白酶。
10.一种以病毒蛋白酶为靶点的蛋白酶抑制剂抗病毒候选药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
11.一种病毒蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
