本发明属于生物工程与基因编辑，具体涉及一种单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3及其制备方法和应用。
背景技术：
1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是美国食品和药物管理局证实的一种通常被认为是安全的微生物，且其具有高表达和分泌胞外蛋白的特性，因此枯草芽孢杆菌常常被用于工业发酵的理想表达宿主。利用代谢工程和基因工程手段对枯草芽孢杆菌进行遗传改造，能够大幅提高枯草芽孢杆菌的胞外蛋白表达量以及消除野生特性带来的发酵阻遏。由于枯草芽孢杆菌自身同源修复能力较弱，因此传统的同源重组法用于枯草芽孢杆菌的遗传改造会出现编辑效率低、耗时长、抗性基因的大量引入等困局，这也造成目前缺乏合适的枯草芽孢杆菌基因编辑工具、对枯草芽孢杆菌的基因修饰较为困难。因此急需开发一种高效、便捷基因编辑工具用于枯草芽孢杆菌的基因编辑。
2、crispr-cas9系统的发现及其介导的基因编辑技术为枯草芽孢杆菌遗传修饰工具的开发提供了新的思路。目前该技术已在大肠杆菌、酵母菌、人源细胞等中实现了高效的基因编辑。但是上述方法实现的基因编辑往往需要切割双链及引入同源修复模板，双链的断裂容易因其细菌死亡，而外源引入供体修复片段不利于多基因的敲除。而单碱基编辑技术的出现有效地克服了这一问题。单碱基基因编辑技术，指能在基因组特定位点引起单个碱基替换的基因编辑技术。基本原理是将胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶与现存cas9n(d10a)融合而形成，依赖于crispr原理使得靶点远离pam端的4～8位的单个碱基发生改变的基因编辑技术。目前的单碱基基因编辑包括两种，一种是cbes即嘧啶碱基转换技术(c/g到t/a)，另一种是abes，即嘌呤碱基转换技术(a/t到g/c)。
3、例如，中国发明专利cn201710437122.0，公开了一种基于碱基编辑的基因敲除方法及其应用。该基因敲除方法包括：选定待敲除基因的编码区的20bp-ngg目标序列，使其包含完整的目标密码子caa、cag或cga；利用sgrna序列来将be3定位到目标序列以使目标密码子中的目标单碱基c变成t从而相应引入终止密码子taa或tag、tga以实现基因敲除。虽然该方法涉及单碱基编辑技术，并没有对单碱基编辑技术提出进一步改进，例如没有提出单个碱基a/t到g/c基因组定点编辑的原始创新和相关原理，更没有提出同时两种不同原理和编辑方式并存的创新思路和相关原理，其仍然是通过将单个碱基c/g编辑成t/a从而实现基因敲除的目的。又如，中国发明专利cn201710383003.1，公开了一种定点突变的人工载体系统及定点突变方法，用于水稻基因组碱基定点替换。该方法包括2种调控元件，能够将水稻中的所述靶位点处的c突变为t、a或g；或将所述靶位点处的g突变为a、t或c。虽然该方法能够实现单个碱基c/g到t/a基因组定点编辑，但其仍然是基于胞喀呢去氨酶介导的单碱基替换技术，也没有提出单个碱基a/t到g/c基因组定点编辑的原始创新和相关方法，更没有提出同时两种不同原理和编辑方式并存的创新思路和相关方法。又如，专利wo2015089406，公开了用于基因编辑的cas变体，即改造的cas9蛋白变体和脱氨酶结构域的融合蛋白，其中脱氨酶选自胞脱氨酶(如apobec1家族脱氨酶acf1/ase脱氨酶)、腺嘌呤脱氨酶(如adat家族脱氨酶)。该专利申请提出既可以使用修饰的胞首脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶，用于对靶dna序列修饰与疾病或失调相关的点突变，例如修正c变t和/或g变a点突变，以实现单个碱基c/g到t/a基因组定点编辑。再如，中国发明专利cn201810930979.0，公开了一种新型碱基转换编辑系统的构建方法及其应用，所构建的编辑系统除了保留单碱基基因编辑系统的功能一即实现指定位点单个碱基c/g到t/a的转换，以及指定位点a/t到g/c转换同时也能实现指定位点c/g到t/a、和a/t到g/c的同时转换，所述碱基转换编辑系统的“一定顺序”具体是指胞嘧啶脱氨酶-腺嘌呤脱氨酶(野生型)-腺嘌呤脱氨酶(突变型)-cas9核酸酶(d10)，同时实现双碱基突变的效率最高仅为10.45％，可能是由于编辑系统顺序设计不合理。
4、随着基因编辑技术的发展突飞猛进，可以预料其将广泛用于食品安全、物种改良等广大领域。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3及其制备方法和应用，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3能够实现特定碱基c-to-t和/或a-to-t的转变，显著提高了碱基编辑的效率，可应用于枯草芽孢杆菌基因失活的突变、基因功能验证。
2、为了达到上述目的，本发明提供了一种单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3，其特征在于，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3包含：融合蛋白和grna scaffold；所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述grna scaffold的核苷酸序列如seq idno.3所示。
3、优选地，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的基础骨架载体为pmhb-3，该基础骨架载体pmhb-3的元件包括：抗生素筛选标记基因、自主复制子基因以及温敏型复制子基因。
4、优选地，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的完整基因序列如seq id no.4所示。
5、本发明的另一目的是提供所述的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的构建方法，该构建方法包含：
6、(1)基础骨架载体pmhb-3的构建
7、以prh030质粒为模板，该prh030质粒中含有抗生素筛选标记基因、自主复制子基因和温敏型复制子基因的组合片段mix3，引物的核苷酸序列如seq id no.6和seq id no.7所示，pcr扩增，获得组合片段mix3；利用one step cloning kit重组连接技术，将组合片段mix3环化，以获得基础载体pmhb-3；
8、(2)融合蛋白表达盒的构建
9、构建含有核苷酸序列如seq id no.2所示表达框的融合蛋白表达盒pmd18-t-t3；
10、(3)grna scaffold表达盒的构建
11、构建含有核苷酸序列如seq id no.3所示sgrna-scaffold的grna scaffold表达盒pmd18-t-gs2；
12、(4)单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的构建
13、利用核苷酸序列如seq id no.8和seq id no.9所示的引物，以pmd18-t-t3质粒为模板，进行目的片段的扩增；利用核苷酸序列如seq id no.10和seq id no.11所示的引物，以pht-43载体为模板，扩增启动子pgrac；将两个片段进行胶回收，验证正确后，利用重组连接的方式，将两个片段连接到所述基础骨架载体pmhb-3上，构建出载体pmhb-4；利用核苷酸序列如seq id no.12和seq id no.13所示的引物，以pmd18-t-gs2质粒为模板，进行目的片段的扩增，将片段进行胶回收，验证正确后，利用重组连接的方式，将其连接到所述载体pmhb-4上，构建出单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3。
14、本发明的另一目的是提供所述的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3在枯草芽孢杆菌中进行特定碱基c-to-t和/或a-to-t的转变中的应用。
15、优选地，在枯草芽孢杆菌中对egfp基因序列进行c-to-t和/或a-to-t的转变以沉默egfp基因；针对碱基c-to-t转变，设计的sgrna的核苷酸序列如seq id no.14所示；针对碱基a-to-t转变，设计的sgrna的核苷酸序列如seq id no.19所示。
16、优选地，将核苷酸序列如seq id no.14或seq id no.19所示的sgrna合成到所述的grna scaffold表达盒上，连接到pbe-c2a-t3载体上，构建pbe-c2a-t3-c/t编辑质粒或pbe-c2a-t3-a/t编辑质粒；将所述pbe-c2a-t3-c/t编辑质粒或/和pbe-c2a-t3-a/t编辑质粒热激法转化大肠杆菌，随后提质粒，并电转进枯草芽孢杆菌宿主中，通过菌液pcr和测序验证阳性克隆子。
17、本发明的另一目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含依次连接的：胞苷脱氨酶tada*、linker、烷基腺嘌呤dna糖基化酶aag、linker、cas9 nickase、linker和腺苷脱氨酶aid，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
18、优选地，该融合蛋白的表达框的核苷酸序列如seq id no.2所示。
19、本发明的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3及其制备方法和应用，具有以下优点：
20、本发明单碱基编辑工具含有编码融合蛋白的多个核苷酸序列，融合蛋白主要包含cas9 nickase、linker、烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)、胞苷脱氨酶(tada*)和腺苷脱氨酶(aid)，cas9核酸酶按一定顺序同时融合特定类型的两种脱氨酶(胞嘧啶脱氨酶与腺嘌呤脱氨酶)与烷基腺嘌呤dna糖基化酶，排列顺序为：tada*-linker-aag-linker-cas9 nickase-linker-aid。本发明单碱基编辑工具pbe-c2a-t3可实现特定碱基c-to-t和/或a-to-t的转变。
21、本发明的单基因编辑器pbe-c2a-t3，不但能够保留单一碱基突变的功能，还同时能够实现两种碱基的转换，设计两个grna scaffold表达盒进行串联，且编辑效率更高，可应用于枯草芽孢杆菌基因失活的突变、基因功能验证，编辑更多的突变体，获得更多的随机突变或者得到突变更多的突变体库，为crispr/cas9基因编辑系统又提供了一个优秀的基因资源，具有重大的研究意义和社会价值。
1.一种单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3，其特征在于，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3包含：融合蛋白和grna scaffold；
2.根据权利要求1所述的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3，其特征在于，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的基础骨架载体为pmhb-3，该基础骨架载体pmhb-3的元件包括：抗生素筛选标记基因、自主复制子基因以及温敏型复制子基因，所述抗生素筛选标记基因、自主复制子基因和温敏型复制子基因的组合片段的核苷酸序列如seq id no.5所示。
3.根据权利要求1所述的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3，其特征在于，该单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的完整基因序列如seq id no.4所示。
4.如权利要求1～3中任意一项所述的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3的构建方法，其特征在于，该构建方法包含：
5.如权利要求1～3中任意一项所述的单碱基基因编辑器pbe-c2a-t3在枯草芽孢杆菌中进行特定碱基c-to-t和/或a-to-t的转变中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在枯草芽孢杆菌中对egfp基因序列进行c-to-t和/或a-to-t的转变以沉默egfp基因；针对碱基c-to-t转变，设计的sgrna的核苷酸序列如seqid no.14所示；针对碱基a-to-t转变，设计的sgrna的核苷酸序列如seq id no.19所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将核苷酸序列如seq id no.14或seq idno.19所示的sgrna合成到如权利要求4中所述的grna scaffold表达盒上，连接到pbe-c2a-t3载体上，构建pbe-c2a-t3-c/t编辑质粒或pbe-c2a-t3-a/t编辑质粒；
8.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包含依次连接的：胞苷脱氨酶tada*、linker、烷基腺嘌呤dna糖基化酶aag、linker、cas9 nickase、linker和腺苷脱氨酶aid，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的表达框的核苷酸序列如seq id no.2所示。
