本发明属于医学材料，涉及一种靶向抗体介导排斥反应的超声造影剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、器官移植术后移植物存活率始终是困扰临床医生的重大难题，以心脏移植为例，其1年生存率不足90％、10年生存率不足60％。随着免疫抑制治疗策略的改善，曾经备受关注的急性细胞性排斥反应的发生率已显著降低，抗体介导排斥反应(amr)成为导致移植物功能衰竭的重要原因。研究表明，急性amr是导致术后早期移植物失功的重要机制；此外，amr所致的微血管炎病变是移植物血管病变的关键基础病变，是导致术后远期移植物功能衰竭的主要因素。更值得注意的是，amr的治疗方式显著有别于临床常规的免疫抑制治疗，如不能及时诊断，更可能延误治疗，导致不可逆的移植物损伤。因此，amr及时、准确诊断对于改善移植患者预后具有重大意义。
2、目前amr的诊断金标准为组织活检病理学，但是组织活检为有创检查，存在多种严重并发症，且存在抽样误差、漏诊率高的弊端。然而，目前文献报道的无创评估方法存在局限性。血液学标志物如dsas水平、micro rna、外泌体、细胞游离供体来源dna(cfdna)、外周血allomap基因检测等有助于移植心脏amr的诊断，但是存在特异性差、阳性预测值低等弊端，进一步确诊仍需活检组织学检查。常规超声心动图和心脏磁共振是临床常用的监测心脏结构和功能的检查方法，但缺乏amr的特异性指标。
3、微泡是临床广泛应用的超声造影剂，靶向微泡更是广泛应用于血管壁或血管内皮的病变。已有报道利用靶向微泡超声分子成像进行临床患者肿瘤疾病的早期诊断，表现出良好的安全性，基本无不良反应。amr的基本病理变化即血管壁的炎性病变，是靶向微泡的良好应用场景。然而，选择微泡的特异性靶点是解决amr超声分子成像的关键。
4、研究表明，nk细胞活化是介导实质脏器amr的重要环节，其表面igg fc受体cd16a是促进nk细胞活化的关键分子。一方面，cd16a介导nk细胞活化的过程普遍存在于移植物amr病变中，以其为靶点可有效提高探针的敏感性；另一方面，cd16a高表达及其介导的nk细胞活化是amr的特征性病理过程，在急性细胞性排斥反应中基本不表达，以其为靶点可有效提高探针的靶向特异性。但目前尚未有特异性靶向amr的特征性微泡超声造影剂。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向抗体介导排斥反应的超声造影剂及其制备方法和应用。本发明中的超声造影剂以脂质为壳膜材料，壳膜内部包裹有气态氟碳，壳膜材料表面结合有链霉亲和素，链霉亲和素与生物素修饰的cd16a抗体偶联。本发明首次以cd16a分子为靶点制备特征性靶向抗体介导排斥反应的分子探针，与传统的分子探针相比，提高分子探针对amr的靶向准确性，实现了amr的便携、实时评估。本发明在抗体介导排斥反应的预防或治疗中，尤其在器官移植术后移植物存活率的提高中具有良好的应用前景。
2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、本发明提供了一种靶向抗体介导排斥反应的超声造影剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
4、步骤一：生物素化微泡的制备
5、(1)成膜：先将dspc，dspe-peg2000，dspe-peg2000-biotin溶于三氯甲烷制成浓度为18～22mg/ml的磷脂溶液，然后将其按(8～9):(0.5～1):(0.5～1)的摩尔比混匀，接着在氮气流的冲击下使三氯甲烷挥发，直至三氯甲烷挥发干净，并在容器壁上形成一层均匀的磷脂薄膜；
6、(2)抽真空：用封口膜封住容器口，并在封口膜上扎小孔，将容器放入抽滤瓶中抽真空2h以上，充分去除残余的三氯甲烷；
7、(3)水化：容器中加入5～6ml水化液，55～60℃下超声8～12min至溶液澄清透明，并分装入西林瓶，封口；
8、(4)换气：抽尽西林瓶中的空气，并继续抽真空25～35min，然后往西林瓶中充入全氟丙烷0.8～1.2min，充完后保持25～35s，使气体混合均匀，接着继续抽真空4～6s，重复3次上述操作以完成气体置换；
9、(5)震荡：换气后的西林瓶震荡25～35s，然后静置8～12min；
10、(6)微泡分离：震荡完成后的液体为微泡(mbs)和纳泡(nbs)的混合物，离心将微泡和纳泡进行分离，离心参数为280～320rpm，2～4min，上层粒径较大的微泡即为所述生物素化微泡；
11、步骤二：靶向微泡(mbcd16a)的制备
12、(1)亲和素孵育：将所述生物素化微泡与链霉亲和素孵育，每106～8微泡孵育2～4μg链霉亲和素，室温旋转孵育28～32分钟；
13、(2)离心：280～320rpm离心2～4min，共离心3次以除去下层过量亲和素；
14、(3)抗体孵育及离心：将除去过量亲和素的微泡与生物素化抗大鼠cd16a抗体孵育，每107～9微泡孵育2～3μg抗体，室温旋转孵育28～32min，然后280～320rpm离心2～4min，离心3次，弃下层除去游离的抗体，至此，所述靶向微泡mbcd16a，也就是所述超声造影剂，即制备完成。
15、进一步的，所述步骤一中成膜时，使用的dspc磷脂溶液、dspe-peg2000磷脂溶液以及dspe-peg2000-biotin磷脂溶液的浓度均为20mg/ml，混合摩尔比为9:0.5:0.5。
16、进一步的，所述步骤一中水化时，水化液由甘油、1，2丙二醇以及0.1m的tris溶液按照10％:10％:80％的体积比混合并调其ph值到7.4制备而成，其加入体积为5.5ml。
17、进一步的，所述步骤一中换气时，抽尽西林瓶中的空气后继续抽真空的时间为30min，充入全氟丙烷的时间为1min，全氟丙烷充完后的保持时间为30s。
18、进一步的，所述步骤一中震荡时，震荡时间为30s，静置时间为10min。
19、进一步的，所述步骤二中亲和素孵育时，每107微泡孵育3μg链霉亲和素，室温旋转孵育30分钟。
20、进一步的，所述步骤二中抗体孵育时，每108微泡孵育2.5μg抗体，室温旋转孵育30min。
21、更进一步的，所述制备方法中的所有离心参数均为300rpm，3min。
22、本发明还提供了一种使用所述制备方法制成的超声造影剂。
23、本发明还提供了一种所述超声造影剂在抗体介导排斥反应预防和/或治疗产品制备中的应用。
24、进一步的，所述应用为在器官移植术后移植物存活率提高产品制备中的应用。
25、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
26、(1)提高分子探针对amr的靶向准确性
27、cd16a分子是细胞表面igg fc段受体，是促进受体细胞活化的关键分子。cd16a介导的nk细胞活化过程普遍存在于移植物amr病变中，包括补体表达阴性的amr，以其为靶点可有效提高探针的敏感性；cd16a高表达及其介导的nk细胞活化是amr的特征性病理过程，在急性细胞性排斥反应中基本不表达，以其为靶点可有效提高探针的靶向特异性。综上，以cd16a为靶点可提高分子探针对amr的靶向准确性。
28、(2)实现便携、实时评估amr
29、心脏移植术后患者通常在重症监护室中无法移动，且需密切监测移植心脏情况，目前尚无可靠的检查方法可在重症监护室内实时准确评估心脏amr。以amr特异性靶向微泡作为分子探针行超声分子成像检测，方便易行，床旁即可实施，亦可用于术后患者的密切随访，反复使用无明显副作用。结合此探针的高靶向性，可实现amr的便携、实时、精准评估。
1.一种靶向抗体介导排斥反应的超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中成膜时，使用的dspc磷脂溶液、dspe-peg2000磷脂溶液以及dspe-peg2000-biotin磷脂溶液的浓度均为20mg/ml，混合摩尔比为9:0.5:0.5。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中水化时，水化液由甘油、1，2丙二醇以及0.1m的tris溶液按照10％:10％:80％的体积比混合并调其ph值到7.4制备而成，其加入体积为5.5ml。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中换气时，抽尽西林瓶中的空气后继续抽真空的时间为30min，充入全氟丙烷的时间为1min，全氟丙烷充完后的保持时间为30s。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中震荡时，震荡时间为30s，静置时间为10min。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中亲和素孵育时，每107微泡孵育3μg链霉亲和素，室温旋转孵育30分钟。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中抗体孵育时，每108微泡孵育2.5μg抗体，室温旋转孵育30min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中的所有离心参数均为300rpm，3min。
9.使用权利要求1～8任一所述的制备方法制成的超声造影剂。
10.权利要求9所述的超声造影剂在抗体介导排斥反应预防和/或治疗产品制备中的应用。
