本发明涉及生物医药，特别涉及一种水凝胶制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、糖尿病足溃疡(dfu)具有易感染、易复发、高截肢率等特点，是世界范围内非创伤性截肢的首要原因。统计数据表明，我国有超过一亿人次糖尿病患者，其dfu发病率约8％(近1000万人)，且呈逐年递增趋势，形势十分严峻。目前，临床上dfu治疗仍以伤口敷料治疗为主，在改善愈合和功能恢复方面仍存在较大的局限性。因此，研发安全和高效的新型伤口敷料贴剂，实现dfu的高效修复具有重要意义。
2、dfu难以自愈或无法完全愈合，高血糖、氧化应激和细菌感染是其三大主要诱因。通常，伤口在炎症阶段会自发通过免疫系统调控伤口的正常炎症水平。然而，dfu由于持续性高血糖水平诱导活性氧自由基(ros)过量释放，募集大量炎症因子浸润于创面，并在细菌感染和氧化应激损伤等多重刺激下使伤口陷入剧烈炎症反应，进而引起溃疡。研究表明，控制dfu患者的高血糖水平，可有效改善其炎症微环境，在加速dfu修复方面极具潜力。值得一提的是，有研究证实胰岛素的局部给药能有效加速创面成血管、促进成纤维细胞的增殖和胶原沉积，进而促进创面愈合。此外，亦有研究表明，改善dfu微环境的氧化应激和细菌感染可有效减小炎症反应，并促进创面血管和组织再生。通过内部调控dfu高血糖水平，外部改善氧化应激和细菌感染的联合治疗策略是改善dfu修复的有效策略。然而，目前在构建多功能水凝胶制剂，一体化实现dfu创面微环境智能调控方面仍缺乏高效和安全的新型智能化递药系统。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种水凝胶制剂及其制备方法和应用，该水凝胶制剂集“智能降血糖/抗氧化/成血管/抗菌”多功能于一体，具有优良的生物相容性，可通过智能化调控高血糖水平、创面氧化应激反应和细菌感染，有效减小炎症反应，促进创面成血管和组织的修复，并有效规避了低血糖风险。本发明亦有效解决了dfu敷料的生物安全性差、生物利用度差和治疗效果差等系列问题。
2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
3、一种水凝胶制剂，包括天然多酚修饰的聚赖氨酸、苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化多糖聚合物、蛋白类降糖药物、锌离子；所述蛋白类降糖药物与锌离子配位结合后，与天然多酚修饰的聚赖氨酸通过静电作用结合形成载药纳米复合物，所述载药纳米复合物通过硼酸酯键共价连接载于苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化多糖聚合物上。
4、本发明中，天然多酚修饰的聚赖氨酸赋予水凝胶强抗氧化特性，可有效降低细胞内ros水平。天然多酚修饰的聚赖氨酸和苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖通过共价交联可形成内部具有均一稳定三维网络结构的水凝胶，天然多酚中多酚基团与苯硼酸共价交联使其具备葡萄糖响应特性，避免了传统水凝胶中葡萄糖氧化酶和席夫碱组合下的葡萄糖响应释药中存在的葡萄糖氧化酶易降解等缺陷；锌离子可促进蛋白类降糖药物的递送效果并促进创面组织成血管效果。在高血糖环境下，水凝胶基体中苯硼酸基团会与葡萄糖分子竞争性结合，触发nps释放，从而实现智能降血糖/抗氧化/抗感染多功能一体化，以达到更加高效的促进dfu愈合的目的。
5、在本发明的一些实施方式中，所述共价交联通过原位光交联形成。
6、在本发明的一些实施方式中，所述载药纳米复合物与所述苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化多糖聚合物的质量比为1～20：1，如1～10：1、6：5。
7、在本发明的一些实施方式中，所述锌离子源于锌离子盐；所述蛋白类降糖药物与锌离子的质量比为1～50：1。所述锌离子盐包括氯化锌、柠檬酸锌、硝酸锌、醋酸锌的至少一种。
8、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚修饰的聚赖氨酸和蛋白类降糖药物的质量比为0.5～10：1。若多酚基团修饰的聚赖氨酸分子和蛋白类降糖药物的质量比过大，则会引起细胞毒性；若多酚基团修饰的聚赖氨酸分子和蛋白类降糖药物的质量比过小，则持续降血糖效果较差。
9、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚修饰的聚赖氨酸中，天然多酚与聚赖氨酸的摩尔比为1～20：1；如10：1。
10、在本发明的一些实施方式中，所述苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖中，苯硼酸与甲基丙烯酸化壳聚糖的摩尔比为0.1～1：1。
11、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚为含邻苯二酚结构的天然多酚。天然多酚类化合物含有苯酚基，具备强抗氧化性。
12、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚包括没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、儿茶素、茶多酚、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、单宁酸的至少一种。
13、在本发明的一些实施方式中，所述蛋白类降糖药物包括胰岛素和/或glp-1受体激动剂，其中，所述glp-1受体激动剂选自艾塞那肽、利拉鲁肽或度拉糖肽等至少一种，只要能够实现降血糖效果即可。
14、本发明的第二个方面，提出了一种所述的水凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
15、s1：将蛋白质类降糖药物与锌离子混合，再加入天然多酚修饰的聚赖氨酸，得到载药纳米复合物；
16、s2：将载药纳米复合物与苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖混合，再加入光引发剂，紫外光照后制得所述的水凝胶制剂。
17、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚修饰的聚赖氨酸的浓度为0.1～100mg/ml，如1～50mg/ml、5～30mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml等。
18、在本发明的一些实施方式中，所述苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖的浓度为0.1～100mg/ml，如1～50mg/ml、5～30mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml等。本发明中，苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖的浓度过高容易发生凝固现象，过低则无法形成水凝胶。
19、在本发明的一些实施方式中，所述蛋白类降糖药物的浓度为1～20mg/ml。如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18mg/ml。
20、在本发明的一些实施方式中，所述紫外光照的时间为10s～600s，如10s～200s、30s～100s、40s～80s、50s、60s、70s、80s、90s、100s。若紫外光照射的时间过长(＞600s)，则易破坏所负载的蛋白类降糖药物的活性；若紫外光照射的时间过短(＜10s)，则不能形成水凝胶。
21、在本发明的一些实施方式中，所述光引发剂的质量体积浓度为0.1％～10％，如0.5％～1.5％、1.0％等。光引发剂的加入可以实现光交联，若光引发剂的质量体积浓度过大(＞10％)，则引入的杂质成分增加，降低了有效成分的比例；若光引发剂的质量体积浓度过小(＜0.1％)，则不能形成水凝胶。
22、在本发明的一些实施方式中，所述光引发剂为光引发剂2959。
23、在本发明的一些实施方式中，所述光引发剂采用乙醇溶解后再加入反应体系中。
24、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚修饰的聚赖氨酸的制备方法包括以下步骤：将天然多酚活化后，与聚赖氨酸溶液混合反应制得所述天然多酚修饰的聚赖氨酸。
25、在本发明的一些实施方式中，所述的活化采用催化剂进行；所述催化剂包括edc和nhs。
26、在本发明的一些实施方式中，将所述天然多酚和edc加入缓冲溶液中搅拌20～40min，再加入nhs，冰浴下继续搅拌0.5～1.5h，使天然多酚活化。
27、在本发明的一些实施方式中，所述混合反应的温度为18℃～35℃，时间为12h～24h。
28、在本发明的一些实施方式中，所述天然多酚修饰的聚赖氨酸的制备方法包括以下步骤：将所述天然多酚和edc加入缓冲溶液中搅拌20～40min，再加入nhs，冰浴下继续搅拌0.5～1.5h，再与聚赖氨酸溶液于18℃～35℃混合反应12h～24h，在去离子水中透析3～6d，冷冻干燥后制得所述天然多酚修饰的聚赖氨酸。
29、在本发明的一些实施方式中，所述苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖的制备方法包括以下步骤：将苯硼酸活化后，与甲基丙烯酸化壳聚糖溶液混合反应，制得所述的苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖。
30、在本发明的一些实施方式中，将所述的苯硼酸和edc加入甲醇溶液搅拌20～40min，再加入nhs，冰浴下继续搅拌0.5～1.5h，使苯硼酸活化。
31、在本发明的一些实施方式中，所述苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖的制备方法包括以下步骤：将所述的苯硼酸和edc加入甲醇溶液搅拌20～40min，再加入nhs，冰浴下继续搅拌0.5～1.5h，再与甲基丙烯酸化壳聚糖溶液于18℃～35℃混合反应24h～48h，在去离子水中透析4～6d，冷冻干燥后制得所述的苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化壳聚糖。
32、本发明的第三个方面，提出了一种所述的水凝胶制剂在制备糖尿病创面修复材料中应用。
33、在本发明的一些实施方式中，所述的糖尿病创面包括糖尿病皮肤溃疡创面，如糖尿病慢性皮肤溃疡创面。
34、本发明的有益效果是：
35、(1)本发明的水凝胶制剂可实现智能调节高血糖、抗氧化和抗感染的三联疗法策略，其内部为连续的三维多孔网络，具有优良的生物安全性，能支持细胞生长和粘附；该水凝胶制剂可通过葡萄糖响应释放药物，实现对高血糖水平的智能化调控，规避了低血糖的风险；该水凝胶制剂具有强抗氧化活性和抗菌活性，能有效降低创面氧化应激损伤，减小细菌感染；该水凝胶制剂还具有内外联合治疗功效及协同治疗效果，能够有效提高药物利用度及药效，减少对机体的毒副作用；另外，该水凝胶制剂的制备方法简单，反应周期短，易于实现，在促进dfu的愈合方面具有广阔的应用前景。
36、(2)本发明的水凝胶递送不同种类的促进伤口愈合的蛋白类降糖药物，在高血糖环境下，可迅速释放所负载的蛋白类降糖药物，实现高效降血糖的功效，从而可显著提高药物的生物利用度，并减少低血糖风险。
37、(3)本发明的水凝胶制剂可发挥天然多酚基团的抗氧化作用，具有优良的dpph自由基清除能力，能够显著改善细胞内ros水平；还能有效抑制大肠杆菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)的生长增殖，对促进糖尿病皮肤溃疡创面的愈合具有重要意义。
38、(4)本发明一体化水凝胶制剂的制备方法简单，具有反应成胶性能好、制备工艺简单、易于实现和绿色安全等优势，可大规模推广应用，在制备糖尿病皮肤溃疡创面修复材料中具有优良的应用前景。
1.一种水凝胶制剂，其特征在于：包括天然多酚修饰的聚赖氨酸、苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化多糖聚合物、蛋白类降糖药物、锌离子；所述蛋白类降糖药物与锌离子配位结合后，与天然多酚修饰的聚赖氨酸通过静电作用结合形成载药纳米复合物，所述载药纳米复合物通过硼酸酯键共价连接载于苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化多糖聚合物上。
2.根据权利要求1所述的水凝胶制剂，其特征在于：所述水凝胶通过原位光交联形成。
3.根据权利要求1所述的水凝胶制剂，其特征在于：所述载药纳米复合物与所述苯硼酸修饰的甲基丙烯酸化多糖聚合物的质量比为1～20：1。
4.根据权利要求1所述的水凝胶制剂，其特征在于：所述锌离子源于锌离子盐；所述蛋白类降糖药物与锌离子盐的质量比为1～50：1。
5.根据权利要求1所述的水凝胶制剂，其特征在于：所述天然多酚修饰的聚赖氨酸和蛋白类降糖药物的质量比为0.5～10：1。
6.根据权利要求1所述的水凝胶制剂，其特征在于：所述天然多酚包括没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、儿茶素、茶多酚、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、单宁酸的至少一种。
7.根据权利要求1所述的水凝胶制剂，其特征在于：所述蛋白类降糖药物包括胰岛素和/或glp-1受体激动剂。
8.一种权利要求1～7任一项所述的水凝胶制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.一种权利要求1～7任一项所述的水凝胶制剂在制备糖尿病创面修复材料中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的糖尿病创面包括糖尿病皮肤溃疡创面。
