本发明涉及生物工程领域，尤其涉及骨架质粒、重组质粒以及猴痘病毒颗粒和应用。
背景技术：
1、猴痘(monkeypox,mpox)是一种由猴痘病毒(mpox virus,mpxv)引起的人畜共患传染病，主要由被感染的动物、受到污染的材料以及具有传染性的人通过直接接触，经受损皮肤或粘膜侵入人体而感染传播。感染猴痘后常见症状是皮疹或粘膜病变，伴有发烧、头痛、肌肉疼痛、疲倦、淋巴结肿大等，致死率从0％到11％不等。猴痘病毒于20世纪50年代首次在非洲非人类灵长类动物发现，在70年代的刚果首次确诊人类感染猴痘病毒，其后该病毒在非洲大陆蔓延，主要是中非和西非，但也逐渐在全球范围传播。特别是2022年夏季，猴痘疫情在全球范围内爆发流行，波及一百多个国家，主要在男男性行为人群传播。
2、猴痘纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病进行管理，采取乙类传染病的预防、控制措施。
3、mpxv属于痘病毒科(poxviridae)正痘病毒属(orthopoxvirus)，是有包膜的双链dna病毒，主要分为中非i和西非ii两支，其中ii又可分为iia和iib分支。2022年全球多国爆发流行毒株为iib分支，临床症状较轻，致死率约为0.1％。目前针对猴痘的候选药物和疫苗不足，而其感染致病和传播流行机制待深入了解。
4、mpxv属于生物安全三级的病毒，涉及mpxv真病毒的操作需要在三级的生物安全实验室完成，严重限制了对mpxv的研究。因此，建立一种能够在低级别生物安全实验室进行操作的病毒模型，用于高效快速的评价针对mpxv的抗病毒药物和疫苗免疫效果，研究病毒感染生命周期(如入胞、复制)和致病机制，以及疫苗开发等，具有重要意义。
5、mpxv的基因组较大，是全长约197kb的线性双链dna，编码约200个蛋白，因此对其基因组的改造难度高。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了骨架质粒、重组质粒以及猴痘病毒颗粒和应用。本发明提供的重组质粒的构建方法简单。只将两个末端反向重复序列的连接片段与一个线性化质粒进行体外重组拼接拯救病毒；骨架质粒改造便捷。经细菌内同源片段重组方法可快速改造目的序列；检测便利。同时表达荧光蛋白和荧光素酶报告基因，方便检测观察；使用安全。病毒颗粒组装所必需的关键基因l2r缺失或者l2r与a30.5l基因同时缺失，在无反向互补表达的细胞上只能进行单轮的入胞和复制，不能组装产生新的病毒颗粒，因而可在生物安全级别较低实验室开展病毒病原学及应用研究，如抗病毒药物筛选、免疫评价和病毒感染机制研究等。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了骨架质粒，包括：骨架质粒1或骨架质粒2；
4、所述骨架质粒1包括：删除病毒的l2r基因和两个末端的反向重复序列；
5、所述骨架质粒2包括：删除病毒的l2r基因、a30.5l基因和两个末端的反向重复序列；
6、所述病毒包括：猴痘病毒。
7、在本发明的一些实施方案中，上述骨架质粒中，所述l2r基因具有：
8、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或
9、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
10、(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
11、所述a30.5l基因具有：
12、(4)、如seq id no:45所示的核苷酸序列；或
13、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
14、(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
15、在本发明的一些实施方案中，上述骨架质粒中，所述两个末端包括5’端和3’端；
16、所述5’端的反向重复序列具有：
17、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或
18、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
19、(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
20、所述3’端的反向重复序列具有：
21、(7)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或
22、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
23、(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
24、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:1的序列为：atggaggtgatcgctgatagactggacgacatcgtgaagcagaacatcgccgacgagaagttcgtggacttcgtgatccacggcctggaacaccagtgccccgccatcctgagacctctgatccggctgttcatcgacatcctgctgtttgtgattgtgatctacatcttcaccgtgcggctggtgtctagaaactaccagatcctgctcgttctggtcgccctggtgattacactgaccatcttcctgctgctgtacaccatcatcgtgctggat。
25、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:2的序列为：
26、
27、
28、
29、
30、在本发明的一些实施方案中，上述seq id no:3的序列为：
31、
32、
33、
34、
35、
36、
37、本发明还提供了骨架质粒的构建方法，所述骨架质粒1的构建包括如下步骤：
38、s1：获得删除所述l2r基因和两个末端的反向重复序列的病毒基因组片段；
39、s2：取s1获得的病毒基因组片段与穿梭质粒连接，酶切后，获得融合片段；
40、s3：取所述融合片段连接，获得所述骨架质粒1。
41、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，s2中所述病毒基因组片段中包括含有胸苷激酶基因的片段，该片段经改造后，再与穿梭质粒连接。
42、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述改造包括：插入启动子、荧光蛋白和荧光素酶报告基因的步骤。
43、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述启动子包括：猴痘病毒晚期启动子p11；所述荧光蛋白包括：mgreenlantern、gfp、egfp、mneongreen、turbogfp、zsgreen、mcherry、mifp和mscarlet3中的一种或多种；所述荧光素酶报告基因包括：gaussia荧光素酶报告基因、nanoluc luciferase、firefly luciferase和renilla luciferase中的一种或多种。
44、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述启动子包括：猴痘病毒晚期启动子p11；所述荧光蛋白包括：mgreenlantern；所述荧光素酶报告基因包括：gaussia荧光素酶报告基因。
45、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述荧光素酶报告基因通过p2a连接肽插入。
46、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，s1中所述病毒基因组片段包括f1～f23；
47、所述f1具有如seq id no:8所示的序列：
48、
49、
50、
51、
52、
53、所述f2具有如seq id no:9所示的序列：
54、
55、
56、
57、
58、
59、所述f3具有如seq id no:10所示的序列：
60、
61、
62、
63、
64、
65、所述f4具有如seq id no:11所示的序列：
66、
67、
68、
69、
70、
71、所述f5具有如seq id no:12所示的序列：
72、
73、
74、
75、
76、
77、所述f6具有如seq id no:13所示的序列：
78、
79、
80、
81、
82、
83、所述f7具有如seq id no:14所示的序列：
84、
85、
86、
87、
88、
89、
90、所述f8具有如seq id no:15所示的序列：
91、
92、
93、
94、
95、
96、所述f9具有如seq id no:16所示的序列：
97、
98、
99、
100、
101、
102、所述f10具有如seq id no:17所示的序列：
103、
104、
105、
106、
107、
108、所述f11具有如seq id no:18所示的序列：
109、
110、
111、
112、所述f12具有如seq id no:19所示的序列：
113、
114、
115、
116、
117、
118、
119、所述f13具有如seq id no:20所示的序列：
120、
121、
122、
123、
124、
125、所述f14具有如seq id no:21所示的序列：
126、
127、
128、
129、
130、
131、所述f15具有如seq id no:22所示的序列：
132、
133、
134、
135、
136、
137、所述f16具有如seq id no:23所示的序列：
138、
139、
140、
141、
142、
143、所述f17具有如seq id no:24所示的序列：
144、
145、
146、
147、
148、
149、
150、所述f18具有如seq id no:25所示的序列：
151、
152、
153、
154、
155、
156、所述f19具有如seq id no:26所示的序列：
157、
158、
159、
160、
161、
162、所述f20具有如seq id no:27所示的序列：
163、
164、
165、
166、
167、
168、
169、所述f21具有如seq id no:28所示的序列：
170、
171、
172、
173、
174、
175、所述f22具有如seq id no:29所示的序列：
176、
177、
178、
179、
180、
181、所述f23具有如seq id no:30所示的序列：
182、
183、
184、
185、
186、
187、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，s3中所述融合片段包括：融合片段b～融合片段g；
188、所述融合片段b包括：f3～f6；
189、所述融合片段c包括：f7～f10；
190、所述融合片段d包括：f11；
191、所述融合片段e包括：f12～f15；
192、所述融合片段f包括：f16～f19；
193、所述融合片段g包括：f20～f23。
194、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述融合片段b具有如seq id no:31所示的序列：
195、
196、
197、
198、
199、
200、
201、
202、
203、
204、
205、
206、
207、
208、
209、
210、
211、
212、
213、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述融合片段c具有如seq id no:32所示的序列：
214、
215、
216、
217、
218、
219、
220、
221、
222、
223、
224、
225、
226、
227、
228、
229、
230、
231、
232、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述融合片段d具有如seq id no:33所示的序列：
233、
234、
235、
236、
237、
238、
239、
240、
241、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述融合片段e具有如seq id no:34所示的序列：
242、
243、
244、
245、
246、
247、
248、
249、
250、
251、
252、
253、
254、
255、
256、
257、
258、
259、
260、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述融合片段f具有如seq id no:35所示的序列：
261、
262、
263、
264、
265、
266、
267、
268、
269、
270、
271、
272、
273、
274、
275、
276、
277、
278、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述融合片段g具有如seq id no:36所示的序列：
279、
280、
281、
282、
283、
284、
285、
286、
287、
288、
289、
290、
291、
292、
293、
294、
295、
296、
297、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，所述含有胸苷激酶基因的片段为f11。
298、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述骨架质粒2的构建包括如下步骤：
299、s1：获得删除所述a30.5l基因的sgrna表达质粒和删除所述a30.5l基因的病毒基因组片段；
300、s2：取所述骨架质粒1和cas9表达质粒转入细胞，获得感受态细胞；
301、s3：取s1中的所述sgrna表达质粒和所述病毒基因组片段转入s2获得的所述感受态细胞，抗性筛选后，获得所述骨架质粒2。
302、本发明还提供了重组质粒，包括：重组质粒1或重组质粒2；
303、所述重组质粒1包括：如下任意项和病毒的两个末端的反向重复序列的片段；
304、(i)、上述骨架质粒中的所述骨架质粒1；和/或
305、(ii)、上述构建方法获得的骨架质粒1；
306、所述重组质粒2包括：如下任意项和病毒的两个末端的反向重复序列的片段；
307、(i)、上述骨架质粒中的所述骨架质粒2；和/或
308、(ii)、上述构建方法获得的骨架质粒2；
309、所述病毒包括：猴痘病毒。
310、在本发明的一些实施方案中，上述重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
311、s1：分别扩增两个末端的反向重复序列，连接，获得片段；
312、s2：分别取所述骨架质粒1和所述骨架质粒2酶切、纯化后，与所述片段连接，分别获得所述重组质粒1和重组质粒2。
313、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法s1中所述片段具有如seq id no:37所示的序列：
314、
315、
316、
317、
318、
319、
320、
321、
322、
323、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法，s1中所述扩增采用引物组1和引物组2；
324、所述引物组1具有：
325、(13)、如seq id no:4和seq id no:5所示的核苷酸序列；或
326、(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
327、(15)、与(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
328、所述引物组2具有：
329、(16)、如seq id no:6和seq id no:7所示的核苷酸序列；或
330、(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
331、(18)、与(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
332、本发明还提供了猴痘病毒的反向互补系统，包括：如下任意项和表达猴痘病毒l2r基因的细胞系或表达猴痘病毒l2r基因和a30.5l基因的细胞系；
333、(i)、上述重组质粒；和/或
334、(ii)、上述构建方法获得的重组质粒。
335、在本发明的一些实施方案中，上述反向互补系统中，所述表达猴痘病毒l2r基因的细胞系经如下步骤获得：
336、s1：获得含有所述l2r基因的质粒后，与慢病毒包装质粒转染细胞，获得慢病毒；
337、s2：取所述慢病毒转导cv-1细胞后，获得所述表达猴痘病毒l2r基因的细胞系。
338、在本发明的一些实施方案中，上述反向互补系统，s1中所述l2r基因的5’端含有蛋白标签。
339、在本发明的一些实施方案中，上述反向互补系统中，所述蛋白标签包括：ha标签。
340、在本发明的一些实施方案中，上述反向互补系统中，所述表达猴痘病毒l2r基因和a30.5l基因的细胞系经如下步骤获得：
341、s1：获得含有所述a30.5l基因的质粒后，与慢病毒包装质粒转染细胞，获得慢病毒；
342、s2：取所述慢病毒转导所述表达猴痘病毒l2r基因的细胞系，获得所述表达猴痘病毒l2r基因和a30.5l基因的细胞系。
343、在本发明的一些实施方案中，上述反向互补系统s1中所述a30.5l基因的5’端含有蛋白标签。
344、在本发明的一些实施方案中，上述反向互补系统中，所述蛋白标签包括：flag标签。
345、本发明还提供了猴痘病毒颗粒的制备方法，取上述反向互补系统转染细胞，培养后，获得所述猴痘病毒颗粒。
346、在本发明的一些实施方案中，上述细胞包括cv-1-l2r细胞。
347、本发明还提供了上述制备方法获得的猴痘病毒颗粒。
348、本发明还提供了上述骨架质粒、上述构建方法获得的骨架质粒、上述重组质粒、上述构建方法获得的重组质粒、上述反向互补系统和/或上述猴痘病毒颗粒在抗病毒药物筛选中的应用。
349、本发明还提供了上述骨架质粒、上述构建方法获得的骨架质粒、上述重组质粒、上述构建方法获得的重组质粒、上述反向互补系统和/或上述猴痘病毒颗粒在免疫评价中的应用。
350、本发明还提供了上述骨架质粒、上述构建方法获得的骨架质粒、上述重组质粒、上述构建方法获得的重组质粒、上述反向互补系统和/或上述猴痘病毒颗粒在病毒感染机制研究中的应用。
351、本发明还提供了上述骨架质粒、上述构建方法获得的骨架质粒、上述重组质粒、上述构建方法获得的重组质粒、上述反向互补系统和/或上述猴痘病毒颗粒在制备治疗和/或预防猴痘病毒的药物或制剂中的应用。
352、本发明还提供了药物或制剂，包括上述骨架质粒、上述构建方法获得的骨架质粒、上述重组质粒上述构建方法获得的重组质粒、上述反向互补系统和/或上述猴痘病毒颗粒以及可接受的辅料。
353、在本发明的一些实施方案中，上述药物或制剂中，包括：疫苗。
354、本发明提供了骨架质粒，包括：骨架质粒1或骨架质粒2；所述骨架质粒1包括：删除病毒的l2r基因和两个末端的反向重复序列；所述骨架质粒2包括：删除病毒的l2r基因、a30.5l基因和两个末端的反向重复序列；所述病毒包括：猴痘病毒。
355、本发明的有益效果包括：
356、(1)、操作简单。只有两个末端反向重复序列片段与一个质粒进行体外拼接拯救病毒，操作简单化；
357、(2)、检测便利。同时表达荧光蛋白和荧光素酶报告基因，方便检测观察；
358、(3)、使用安全。缺失病毒颗粒组织所必需的关键基因l2r，在无l2r表达的野生型细胞上只能进行单轮的入胞和复制，不能包装产生新的病毒颗粒，因而可在生物安全级别较低实验室开展病毒病原学及应用研究，如抗病毒药物筛选、免疫评价和病毒感染机制研究等。
1.骨架质粒，其特征在于，包括：骨架质粒1或骨架质粒2；
2.如权利要求1所述的骨架质粒，其特征在于，所述l2r基因具有：
3.如权利要求1或2所述的骨架质粒，其特征在于，所述两个末端包括5’端和3’端；
4.如权利要求1至3任一项所述的骨架质粒的构建方法，其特征在于，所述骨架质粒1的构建包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，s2中所述病毒基因组片段中包括含有胸苷激酶基因的片段，该片段经改造后，再与穿梭质粒连接。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述改造包括：插入启动子、荧光蛋白和荧光素酶报告基因的步骤。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述启动子包括：猴痘病毒晚期启动子p11；所述荧光蛋白包括：mgreenlantern、gfp、egfp、mneongreen、turbogfp、zsgreen、mcherry、mifp和mscarlet3中的一种或多种；所述荧光素酶报告基因包括：gaussia荧光素酶报告基因、nanoluc luciferase、firefly luciferase和renilla luciferase中的一种或多种。
8.如权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述荧光素酶报告基因通过p2a连接肽插入。
9.如权利要求4至8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述骨架质粒2的构建包括如下步骤：
10.重组质粒，其特征在于，包括：重组质粒1或重组质粒2；
11.如权利要求10所述重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
12.如权利要求11所述的构建方法，其特征在于，s1中所述扩增采用引物组1和引物组2；
13.猴痘病毒的反向互补系统，其特征在于，包括：如下任意项和表达猴痘病毒l2r基因的细胞系或表达猴痘病毒l2r基因和a30.5l基因的细胞系；
14.如权利要求13所述的反向互补系统，其特征在于，所述表达猴痘病毒l2r基因的细胞系经如下步骤获得：
15.如权利要求14所述的反向互补系统，其特征在于，s1中所述l2r基因的5’端含有蛋白标签。
16.如权利要求15所述的反向互补系统，其特征在于，所述蛋白标签包括：ha标签。
17.如权利要求13所述的反向互补系统，其特征在于，所述表达猴痘病毒l2r基因和a30.5l基因的细胞系经如下步骤获得：
18.如权利要求17所述的反向互补系统，其特征在于，s1中所述a30.5l基因的5’端含有蛋白标签。
19.如权利要求18所述的反向互补系统，其特征在于，所述蛋白标签包括：flag标签。
20.猴痘病毒颗粒的制备方法，其特征在于，取如权利要求13至19任一项所述的反向互补系统转染细胞，培养后，获得所述猴痘病毒颗粒。
21.如权利要求20所述的制备方法获得的猴痘病毒颗粒。
22.如权利要求1至3任一项所述的骨架质粒、如权利要求4至9任一项构建方法获得的骨架质粒、如权利要求10所述的重组质粒、如权利要求11或12所述构建方法获得的重组质粒、如权利要求13至19任一项所述的反向互补系统和/或如权利要求21所述的猴痘病毒颗粒在抗病毒药物筛选中的应用。
23.如权利要求1至3任一项所述的骨架质粒、如权利要求4至9任一项构建方法获得的骨架质粒、如权利要求10所述的重组质粒、如权利要求11或12所述构建方法获得的重组质粒、如权利要求13至19任一项所述的反向互补系统和/或如权利要求21所述的猴痘病毒颗粒在免疫评价中的应用。
24.如权利要求1至3任一项所述的骨架质粒、如权利要求4至8任一项构建方法获得的骨架质粒、如权利要求10所述的重组质粒、如权利要求11或12所述构建方法获得的重组质粒、如权利要求13至19任一项所述的反向互补系统和/或如权利要求21所述的猴痘病毒颗粒在病毒感染机制研究中的应用。
25.如权利要求1至3任一项所述的骨架质粒、如权利要求4至8任一项构建方法获得的骨架质粒、如权利要求10所述的重组质粒、如权利要求11或12所述构建方法获得的重组质粒、如权利要求13至19任一项所述的反向互补系统和/或如权利要求21所述的猴痘病毒颗粒在制备治疗和/或预防猴痘病毒的药物或制剂中的应用。
26.药物或制剂，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的骨架质粒、如权利要求4至9任一项构建方法获得的骨架质粒、如权利要求10所述的重组质粒、如权利要求11或12所述构建方法获得的重组质粒、如权利要求13至19任一项所述的反向互补系统和/或如权利要求21所述的猴痘病毒颗粒以及可接受的辅料。
