本发明属于生物方法处理废水领域，特别涉及一种苯酚降解菌剂的制备方法及应用。
背景技术：
1、苯酚是工业上较为多见的一类污染源，具有毒性大，分布范围广的特点，在市政废水中同样存在，市政污水因水质变化大，总溶解固体、cod等污染物浓度变化频繁，给处理市政污水中的苯酚增加了不少难度。目前世界上的多种苯酚污染治理方法中占据主导地位的有物理法、化学法和生物降解法，以及这几种方法相互联用的处理技术。而苯酚生物降解方法因其具有绿色、高效、经济等优势，并且还可达到相关污染物矿化的目的，因此它在苯酚污染治理行业中被广泛应用。
2、围绕苯酚生物降解已进行了大量研究，文献已报道的用于苯酚降解的微生物种类繁多，有50多个属，200多种苯酚降解菌。如shourian等从制药处理废水中分离出的产碱杆菌能在85h内降解1000mg/l苯酚。张海涛等从海利有限公司污水处理池水样中分离得到耐盐苯酚降解菌不动杆菌acinetobacter guillouiae，该菌株72h内可将800mg/l的苯酚降解93.23％。utkarsh singh等从被富含苯酚的焦炉废水污染的土壤中分离出恶臭假单胞菌和stutzeri假单胞菌，可以同时降解1500mg/l的苯酚和340mg/l的氰化物。周旭从安徽省安某塑料厂的污水排放口附近受污染土壤中分离纯化得到蜡样芽孢杆菌bacillus cereus，可在20.5h完全降解浓度为1200mg/l的苯酚。li jing等人从黑龙江某化工厂污泥中分离出一株菌株，对2200mg/l的苯酚降解率达到38.8％。
3、目前已报道的苯酚降解菌大部分都是从目标环境(如化工厂、工业污水)中分离的土著优势菌，多数苯酚降解菌存在对苯酚的耐受浓度较低(低于2000mg/l)、降解速率较慢、易发生菌株污染等问题。经过前人理论研究，混合菌株在微生物群落中的协同作用在一定程度上能提高抵抗恶劣环境冲击的能力，且操作简单，不需严格无菌。因此，开发一种苯酚降解菌及其驯化方法，能够以苯酚为唯一碳源，对水体中的苯酚污染具有较高的降解速率和浓度耐受限度具有重要应用价值。
技术实现思路
1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种苯酚降解菌剂的制备方法。
2、本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的苯酚降解菌剂。
3、本发明的再一目的在于提供所述苯酚降解菌剂的应用。
4、本发明的目的通过下述技术方案实现：
5、一种苯酚降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
6、(1)菌源获取：将市政污水的活性污泥静置后移除上清液，然后往废水中泵入空气，创造富氧环境；
7、(2)复合培养基驯化
8、①在步骤(1)的废水中加入含有450～550mg/l苯酚的复合培养基进行驯化培养，待废水中的cod去除率达到95％以上，静置，移除上清液，更换新鲜的含有450～550mg/l苯酚的复合培养基，重复此步操作3～5次(优选为4次)；
9、②根据步骤①废水中残余的苯酚浓度，每天补加一次苯酚使其保持在480～540mg/l驯化培养两周；两周后将废水中的苯酚浓度提高至900～1100mg/l，持续驯化，待24h内苯酚去除率达到97％以上，保留菌种，更换新鲜的含有900～1100mg/l苯酚的复合培养基，重复此步操作3～5次(优选为4次)；
10、(3)无机盐培养基驯化：
11、③将步骤②中保留的菌种转移到含有900～1100mg/l苯酚(苯酚作为微生物生长代谢的唯一碳源)的无机盐培养基中，培养驯化至24h内苯酚降解率达到97％以上，静置，移除上清液，更换新鲜的含有900～1100mg/l苯酚的无机盐培养基，重复此步操作4～5次(即驯化4～5个周期，优选为驯化4个周期)；
12、④在步骤③移除上清液后的菌种中加入含有1400～1600mg/l苯酚的无机盐培养基，继续培养驯化至24h内苯酚降解率达到97％以上，静置，去除上清液，更换新鲜的含有1400～1600mg/l苯酚的无机盐培养基，重复此步操作4～5次(即驯化4～5个周期，优选为驯化4个周期)，收集菌液，得到所述的苯酚降解菌剂。
13、步骤(1)中所述的市政污水的活性污泥优选为从市政污水的好氧段取的好氧污泥；进一步优选为从广州市净水公司京溪分公司污水池好氧段取的好氧污泥。
14、步骤(1)和(2)中所述的静置的时间为20～60min；优选为30min。
15、步骤(1)中所述的往废水中泵入空气优选为通过如下步骤实现：将废水转存到反应器中，连接空气泵，并将尾端连接气石的气管浸于废水溶液底部，以大量微小气泡创造富氧环境。
16、所述的反应器的温度为15～39℃；优选为室温。
17、所述的空气泵的通气量为0.45～0.55l/min；优选为0.5l/min。
18、步骤①和②中所述的复合培养基的配方如下：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，无机盐培养基1l；其中，
19、无机盐培养基的配方如下：nacl 10g/l，nh4cl 0.5g/l，kh2po4 0.5g/l，k2hpo4 1g/l，mgso4 0.5g/l，cacl2 0.02g/l，kcl 10g/l，fecl2·4h2o 0.02g/l，体积百分比0.1％的微量元素溶液，121℃灭菌20min；
20、微量元素溶液的配方如下：mnso4 0.0399g/l，znso4·h2o 0.0428g/l，(nh4)2moo4·4h2o 0.0347g/l，121℃灭菌20min。
21、步骤③和④中所述的无机盐培养基的配方如下：nacl 10g/l，nh4cl 0.5g/l，kh2po4 0.5g/l，k2hpo4 1g/l，mgso4 0.5g/l，cacl2 0.02g/l，kcl 10g/l，fecl2·4h2o0.02g/l，体积百分比0.1％的微量元素溶液，121℃灭菌20min；其中，
22、微量元素溶液的配方如下：mnso4 0.0399g/l，znso4·h2o 0.0428g/l，(nh4)2moo4·4h2o 0.0347g/l，121℃灭菌20min。
23、步骤①中，复合培养基中苯酚的浓度优选为500mg/l。
24、步骤②中，复合培养基中苯酚的浓度优选为1000mg/l。
25、步骤③中，无机盐培养基中苯酚的浓度优选为1000mg/l。
26、步骤④中，无机盐培养基中苯酚的浓度优选为1500mg/l。
27、步骤②、③和④中，苯酚浓度检测时间间隔为24h，更换培养基的标准为苯酚去除率达到97％。
28、所述的苯酚降解菌剂的主要组成成分为微杆菌(microbacterium)、无色杆菌(achromobacter)、棒杆菌(corynebacterium)、中华单胞菌(sinomonas)、罗河杆菌(rhodanobacter)，分别占比约为30％、10％、8.8％、8％、6.5％；其中，相对丰度排名前五的优势菌有微杆菌属(microbacterium sp.，18.71％)、环己烷棒状杆菌(corynebacteriumcyclohexanicum，8.68％)、米布鲁氏菌(brucella oryzae，4.86％)、硝酸还原菌(nitratireductor indicus，3.48％)、红杆菌属(rhodanobacter sp.，3.24％)。
29、所述的苯酚降解菌剂的制备方法，在步骤(3)之后还包括保藏的步骤：将苯酚降解菌剂与60％的灭菌甘油按体积比1：1的比例混合均匀，再将其分装在无菌的冻存管中，放入-80℃冰箱中冷藏。
30、所述的苯酚降解菌剂中的有效活菌数量≥109cfu/g。
31、一种苯酚降解菌剂，通过上述任一项所述的方法制备得到。
32、所述的苯酚降解菌剂在降解废水中的苯酚的应用。
33、所述的废水包括化工废水和/或市政污水等。
34、一种降解废水中的苯酚的方法，包括如下步骤：
35、i、菌种激活
36、将上述苯酚降解菌剂按体积比百分比5～15％加入到0.5～2倍浓度的无机盐培养基中，加入终浓度为1200～1500mg/l的苯酚，于20～45℃、100～200rpm条件下培养激活菌种，待菌悬液密度达到1×109cfu/ml以上完成激活培养，得到苯酚降解菌剂激活菌悬液；
37、ii、降解废水中的苯酚
38、将苯酚降解菌剂激活菌悬液静置后移除上清液，获得激活后的苯酚降解菌剂；然后用含有苯酚的废水配制无机盐培养基，得到含有废水的无机盐培养基；再将激活后的苯酚降解菌剂按体积比百分比10～15％加入到含有废水的无机盐培养基中，调节体系ph值至5～9，于20～45℃、100～200rpm条件下进行降解。
39、步骤i中所述的苯酚降解菌剂的添加量优选为体积比百分比5％。
40、步骤i中所述的无机盐培养基优选为0.5倍浓度的无机盐培养基。
41、步骤i和ii所述的无机盐培养基的配方如下：nacl 10g/l，nh4cl 0.5g/l，kh2po40.5g/l，k2hpo4 1g/l，mgso4 0.5g/l，cacl2 0.02g/l，kcl 10g/l，fecl2·4h2o 0.02g/l，体积百分比0.1％的微量元素溶液，121℃灭菌20min；其中，
42、微量元素溶液的配方如下：mnso4 0.0399g/l，znso4·h2o 0.0428g/l，(nh4)2moo4·4h2o 0.0347g/l，121℃灭菌20min。
43、步骤i中所述的苯酚的终浓度优选为1200mg/l。
44、步骤i中所述的激活菌种的条件优选为：温度30℃、转速150rpm，时间48h。
45、步骤ii中所述的激活后的苯酚降解菌剂的添加量优选为体积比百分比10％。
46、步骤ii中所述的废水中苯酚的浓度为2300mg/l以下；优选为0～1500mg/l。
47、步骤ii中所述的降解的条件优选为：温度30℃、转速150rpm，时间24h以上(优选24～48h)。
48、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
49、1、本发明提供了一种苯酚高效降解菌剂，以市政污水中的污泥作为菌源，经驯化获得，主要组成成分为microbacterium、achromobacter、corynebacterium、sinomonas、rhodanobacter，微生物制剂有效活菌数≥109cfu/g，在ph为5-9范围内均可保持高活性，且迟滞期较短，降解启动快，成本低、无二次污染。
50、2、本发明从长期处理市政废水的好氧活性污泥中驯化出高浓度苯酚降解菌，能以苯酚为唯一碳源进行生长，可耐受2300mg/l的苯酚，可快速降解高浓度苯酚；其对于模拟废水中的苯酚均具有较高的降解效率和浓度耐受限度，在最佳条件下，用20h能将1200mg/l苯酚降解至20mg/l以下，苯酚浓度≤1500mg/l时，32h内苯酚降解率98％以上，累计循环15次，菌剂仍然保持高活性，菌株不失活。
51、3、本发明还提供了一种苯酚高效降解菌剂的应用，将废水依次经过苯酚高效降解菌剂激活及培养，再进行废水处理。
52、4、本发明提供的苯酚高效降解菌剂为混合菌，可用自来水培养和使用，对操作条件没有无菌要求，易在工业应用上推广，具有广阔的应用前景。
1.一种苯酚降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的苯酚降解菌剂的制备方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的苯酚降解菌剂的制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的苯酚降解菌剂的制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的苯酚降解菌剂的制备方法，其特征在于：
6.一种苯酚降解菌剂，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.权利要求6所述的苯酚降解菌剂在降解废水中的苯酚的应用。
8.一种降解废水中的苯酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的降解废水中的苯酚的方法，其特征在于：
10.根据权利要求8所述的降解废水中的苯酚的方法，其特征在于：
