本公开涉及生物，具体地，涉及一种抗pd-l1和tigit双特异性抗体及其用途。
背景技术：
1、免疫抑制性受体(irs)在调节慢性病毒感染和癌症的免疫中发挥着重要的作用。在慢性抗原刺激下，t细胞功能失调或衰竭并上调irs，包括程序性细胞死亡受体1(pd-1)和带有免疫球蛋白和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)。同时，肿瘤细胞和抗原呈递细胞(apcs)在肿瘤微环境(tme)中表达ir配体，这导致肿瘤细胞可以逃避免疫监视。
2、tigit(也称为wucam、vstm3、vsig9)是脊髓灰质炎病毒受体(pvr)/黏连蛋白家黏连蛋白家族(隶属于免疫球蛋白超家族)的成员，在淋巴细胞中表达，特别是在效应和调节性cd4+t细胞、滤泡辅助cd4+t细胞、效应cd8+t细胞和自然杀伤(nk)细胞中高表达。tigit与dcs或肿瘤细胞上表达的cd155结合，诱导cd155磷酸化并触发信号级联反应，促进免疫耐受性dcs形成，抑制固有免疫和适应性免疫；tigit还可以直接抑制cd8+t细胞效应，或tigit+treg可以抑制cd8+t细胞，防止癌细胞清除。
3、tigit可通过多种作用机制抑制淋巴细胞活化：首先，tigit是一种与共刺激受体cd226作用完全相反的抑制性受体，当tigit存在于淋巴细胞表面时，与cd226相比，它对其共同配体cd155的亲和力高于cd226，因此，tigit将会竞争性的优先与cd155结合，从而阻断cd226的共刺激效应；其次，tigit可以通过抑制cd226同源二聚体的形成，阻断cd226信号；此外，tigit的胞质尾部含有一种基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(itim)，可能导致信号抑制，有研究表明这是tigit导致t细胞抑制的主要机制。
4、细胞程序性死亡-配体1(pd-l1)是适应性免疫的免疫检查点，正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性t细胞(cd8+t细胞增生)。而pd-1与pd-l1结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结cd8+t细胞的增生，而且pd-1还可以借由调节bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积。
技术实现思路
1、尽管pd-1/pd-pd-l1表达在多种肿瘤(例如，肾癌、胃癌、尿道上皮癌、卵巢癌和黑色素瘤)上，使用pd-l1抗体能杀死肿瘤细胞或抑制杀伤性t细胞的活性。l1抑制剂在肿瘤免疫领域中获得了巨大的成功，但其单药应答率有限(10％～35％)、持续治疗中逐渐出现耐药性或者复发等问题存在。tigit和pd1在t细胞和nk细胞上共表达，抗pd-l1和tigit双特异性抗体，可实现tigit与pd-(l)1通路的协同抑制效果，提高抗肿瘤效果。本公开披露了一种抗pd-l1和tigit双特异性抗体。
2、本公开公开了一种抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其包含特异性结合pd-l1的第一抗原结合域和特异性结合tigit的第二抗原结合域；其中，
3、a)所述特异性结合pd-l1的第一抗原结合域包含重链可变区p-vh和轻链可变区p-vl，所述重链可变区p-vh包含seq id no：3中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列，和所述轻链可变区p-vl包含seq id no：4中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列；和/或
4、b)所述特异性结合tigit的第二抗原结合域包含重链可变区t-vh和轻链可变区t-vl，所述重链可变区t-vh包含seq id no：1中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列，和所述轻链可变区t-vl包含seq id no：2中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列；
5、在一些实施方案中，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3由imgt编号系统定义，或由kabat编号系统定义，或由chothia编号系统定义，或由contact编号系统定义，或由abm编号系统定义。在一些实施方案中，前述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3根据kabat编号系统定义。在一些实施方案中，前述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3根据imgt编号系统定义。
6、在一些实施方案中，如上任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述抗体为鼠源抗体，嵌合抗体或人源化抗体；在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
7、在一些实施方案中，如上任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其中：所述特异性结合pd-l1的第一抗原结合域，所述重链可变区p-vh的hcdr1包含seq id no：11的氨基酸序列、hcdr2包含seq id no：12的氨基酸序列和hcdr3包含seq id no：13的氨基酸序列，和所述轻链可变区p-vl的lcdr1包含seq id no：14的氨基酸序列、lcdr2包含seq idno：15的氨基酸序列和lcdr3包含seq id no：16的氨基酸序列。
8、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其重链可变区p-vh包含分别如seq id no：11、seq id no：12和seq id no：13所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，以及分别如seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
9、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述重链可变区p-vh包含与seq id no：3具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区p-vl包括与seq idno：4具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区p-vh包含seq id no：3的氨基酸序列，和所述轻链可变区p-vl包括seq id no：4的氨基酸序列。
10、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其中：所述特异性结合tigit的第二抗原结合域中，所述重链可变区t-vh的hcdr1包含seq id no：5的氨基酸序列、hcdr2包含seq id no：6的氨基酸序列和hcdr3包含seq id no：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区t-vl的lcdr1包含seq id no：8的氨基酸序列、lcdr2包含seq id no：9的氨基酸序列和lcdr3包含seq id no：10的氨基酸序列。
11、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其重链可变区p-vh包含分别如seq id no：5、seq id no：6和seq id no：7所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，以及分别如seq id no：8、seq id no：9和seq id no：10所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
12、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述重链可变区t-vh包含与seq id no：1具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链可变区t-vl包括与seq idno：2具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区t-vh包含seq id no：1的氨基酸序列，和所述轻链可变区t-vl包括seq id no：2的氨基酸序列。
13、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其包括重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区选自igg1、igg2、igg3和igg4的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ或λ链恒定区；在一些实施方案中，所述恒定区的种属来源为鼠或人；在一些实施方案中，所述重链恒定区包括与seq id no：27具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列，和/或所述轻链恒定区包括与seq id no：28具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体包含seq id no：27所示的重链恒定区和seq id no：28所示的轻链恒定区。
14、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述特异性结合pd-l1的第一抗原结合域包含抗体重链恒定区ch和轻链恒定区cl，重链可变区p-vh的c端与重链恒定区ch的n端连接，轻链可变区p-vl的c端与轻链恒定区cl的n端连接；或者所述特异性结合tigit的第二抗原结合域包含抗体重链恒定区ch和轻链恒定区cl，重链可变区t-vh的c端与重链恒定区ch的n端连接，轻链可变区t-vl的c端与轻链恒定区cl的n端连接。在一些实施方案中，所述特异性结合pd-l1的第一抗原结合域包括与seq id no：19具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的重链，和seq id no：20具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的轻链；在一些实施方案中，所述特异性结合tigit的第二抗原结合域包括与seq id no：17具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的重链，和与seq idno：18具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列的轻链；在一些实施方案中，所述特异性结合pd-l1的第一抗原结合域包括seq id no：19所示的重链和seq id no：20所示的轻链。
15、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其中所述特异性结合pd-l1的第一抗原结合域为全长抗体，其包含重链可变区p-vh和重链恒定区ch，以及轻链可变区p-vl和轻链恒定区cl；所述特异性结合tigit的第二抗原结合域为scfv抗原结合片段，其包括重链可变区t-vh和轻链可变区t-vl。在一些实施方案中，所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体包括两条具有式(a)所示结构的第一链和两条具有式(b)所示结构的第二链：
16、(b).[p-vl]-[cl]；
17、(a).[t-vl]-[l1]-[t-vh]-[l2]-[p-vh]-[ch]，[t-vh]-[l1]-[t-vl]-[l2]-[p-vh]-[ch]，
18、[p-vh]-[ch]-[l1]-[t-vl]-[l2]-[t-vh]，或[p-vh]-[ch]-[l1]-[t-vh]-[l2]-[t-vl]；
19、式(a)中，连接子l1和l2优选为肽连接子；在一些实施方案中，所述连接子l1和l2独立地选自(gxs)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自0-6的整数；在一些实施方案中，所述连接子为如seq id no：29或30所示连接子。在一些实施方案中，所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体第一链包括seq id no：21-26任一项所示的氨基酸序列，第二链包括seq idno：20所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体包括2条seq id no：21所示的第一链和2条seq id no：20所示的第二链。在一些实施方案中，所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体包括2条seq id no：26所示的第一链和2条seq id no：20所示的第二链。
20、在一些实施方案中，本公开公开一种抗原结合分子，其与前面任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体竞争性结合人pd-l1和人tigit，或与前面任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体结合相同表位。在一些实施方案中，所述抗原结合分子包含前面任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体。
21、在一些实施方案中，如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子，其具有以下特性中的至少一种：
22、a.能与人pd-l1特异性结合；在一些实施方案中，能以≤10nm(例如，≤5nm、≤4.50nm、≤3.00nm、≤2.50nm、≤2.00nm、≤1.00nm或更小)的ec50值与cho-pdl1细胞结合，其中，所述ec50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述ec50值通过本公开实施例2方法测定；
23、b.能与人tigit特异性结合；在一些实施方案中，其能以≤10nm(例如，≤6nm、≤5.50nm、≤3.00nm、≤2.00nm、≤1.00nm、≤0.9nm、≤0.8nm、≤0.7nm、≤0.6nm、≤0.5nm、≤0.4nm、≤0.3nm、≤0.2nm、≤0.1nm、≤0.05nm、≤0.01nm或更小)的ec50值与cho-tigit细胞结合，其中，所述ec50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述ec50值通过本公开实施例2方法测定；
24、c.能阻断人pdl1与人pd1蛋白结合；在一些实施方案中，其能以≤10nm(例如，≤9nm、≤8nm、≤7nm、≤6nm、≤5nm、≤3nm、≤1nm、≤1nm、≤0.5nm、≤0.1nm、≤0.01nm或更小)的ic50值阻断pd1与cho-pdl1结合，其中，所述ic50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述ic50值通过本公开实施例3方法测定；
25、d.能阻断人tigit与人pvr结合结合；在一些实施方案中，其能以≤10nm(例如，≤5nm、≤4.50nm、≤3.00nm、≤2.00nm、≤1.00nm、≤0.9nm、≤0.8nm、≤0.7nm、≤0.6nm、≤0.5nm、≤0.4nm、≤0.3nm、≤0.2nm、≤0.1nm、≤0.05nm、≤0.01nm或更小)的ic50值阻断pvr与cho-tigit结合，其中，所述ic50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述ic50值通过本公开实施例4方法测定；
26、e.能阻断人pdl1与人cd80蛋白结合；在一些实施方案中，其能以≤10nm(例如，≤9nm、≤8nm、≤7nm、≤6nm、≤5nm、≤3nm、≤1nm、≤1nm、≤0.5nm、≤0.1nm、≤0.01nm或更小)的ic50值阻断cd80与cho-pdl1结合，其中，所述ic50值通过流式细胞分析法测定；在一些实施方案中，所述ic50值通过本公开实施例5方法测定；
27、f.能促进t细胞分泌细胞因子；在一些实施方案中，所述细胞因子为il2；在一些实施方案中，所述il2通过本公开实施例7方法测定；或
28、g.能抑制肿瘤增长；
29、在一些实施方案中，本公开公开一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子。
30、在一些实施方案中，本公开公开一种载体，其含前述的核酸分子。
31、在一些实施方案中，本公开公开一种细胞，其含如上任一项所述的核酸分子或载体。
32、在一些实施方案中，本公开公开一种药物组合物，其包含如上任一项所述所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体或细胞；在一些实施方案中，其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
33、在一些实施方案中，本公开公开如上任一项所述所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体、细胞或药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。在一些实施方案中，所述肿瘤为人pd-l1表达异常相关疾病；在一些实施方案中，所述肿瘤为人tigit表达异常相关疾病。在一些实施方案中，所述肿瘤为人pd-l1高表达相关肿瘤。
34、在一些实施方案中，本公开提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前面任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体、细胞或药物组合物的步骤。在一些实施方案中，所述肿瘤为人pd-l1表达异常的相关疾病；在一些实施方案中，所述肿瘤为人tigit表达异常的相关疾病。在一些实施方案中，所述肿瘤为人pd-l1高表达相关肿瘤。
35、在另一个方面，本公开还提供用作药物的前述任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体、抗原结合分子、核酸分子、载体、细胞或药物组合物。在一些实施方案中，药物用于治疗肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为人pd-l1表达异常相关疾病；在一些实施方案中，所述肿瘤为人tigit表达异常相关疾病。在一些实施方案中，所述肿瘤为人pd-l1高表达相关肿瘤。
36、在一些实施方案中，前面任一项所述的治疗，进一步包括向受试者施用另外的治疗药物。
37、在一些实施方式中，前面任一项所述的疾病，其为pd-l1和/或tigit介导的疾病；在一些实施方式中，所述疾病为肿瘤；在一些实施方式中，为高表达pd-l1的肿瘤。在一些实施方式中，所述的肿瘤包括但不限于黑素瘤癌、肾癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌、头或颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、阴道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，膀胱癌、输尿管癌、中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、垂体腺瘤、脑肿瘤。
38、本公开还提供一种检测或测定人pd-l1和tigit的方法，所述方法包括使用如前任一项所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子的步骤。
39、本公开还提供一种试剂盒，其包含如前任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子；在一些实施方案中，所述试剂盒用于检测或测定人pd-l1和tigit。
40、本公开还提供了一种制备如前任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子的方法，其包括培养如前任一项所述的细胞，然后分离和纯化获得抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子的步骤。
41、本公开公开的抗pd-l1和tigit双特异性抗体或抗原结合分子能够特异性结合人pd-l1和tigit；在一些实施方案中，所述抗pd-l1和tigit双特异性抗体在体外和体内展示良好的抗肿瘤活性。
1.一种抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其包含特异性结合pd-l1的第一抗原结合域和特异性结合tigit的第二抗原结合域，其中，
2.根据权利要求1所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述抗体为鼠源抗体，嵌合抗体或人源化抗体；
3.根据权利要求1或2所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3由imgt编号系统定义，或由kabat编号系统定义，或由chothia编号系统定义，或由contact编号系统定义，或由abm编号系统定义；
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，所述特异性结合tigit的第二抗原结合域中，其中，所述重链可变区t-vh的hcdr1包含seq id no：5的氨基酸序列、hcdr2包含seq id no：6的氨基酸序列和hcdr3包含seq id no：7的氨基酸序列，和所述轻链可变区t-vl的lcdr1包含seq id no：8的氨基酸序列、lcdr2包含seq id no：9的氨基酸序列和lcdr3包含seq id no：10的氨基酸序列；
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，其包括重链恒定区和轻链恒定区；
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体或权利要求8所述的抗原结合分子，其具有以下特性中的至少一种：
7.一种抗原结合分子，其与权利要求1至6任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体竞争性结合人pd-l1和人tigit，或与权利要求1至6任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体结合相同表位。
8.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至6任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体或编码权利要求7所述的抗原结合分子；
9.一种药物组合物，其包含权利要求1至6任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，权利要求7所述的抗原结合分子，权利要求8所述的核酸分子、载体或细胞；可选地，其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.如权利要求1至6任一项所述的抗pd-l1和tigit双特异性抗体，权利要求7所述的抗原结合分子，权利要求8所述的核酸分子、载体或细胞，或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用；
