本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及pdk4作为细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的应用。
背景技术：
1、衰老是一个复杂的生物学过程，伴随组织稳态失衡和功能性损伤，同时衰老相关疾病发病率呈明显增加趋势。衰老与线粒体功能障碍、代谢失调和慢性炎症密切相关。此外，增龄伴随的干细胞数量的减少和功能障碍会引起组织再生和内稳态受损，进而导致组织和机体层面的衰老。
2、大量研究表明，细胞衰老是机体衰老的原始驱动力和最小单位。细胞衰老是一个细胞进入永久性细胞周期停滞的过程。细胞衰老常伴随许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤可以导致明显的细胞衰老迹象；当损伤累积和达到一定的限度，组织中则呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。
3、衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,sasp)的概念是由coppe等人在2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变，并称这些蛋白为sasp因子。体内条件下，衰老细胞在各个器官积累的同时伴随一系列复杂的sasp，它是不同种类细胞因子的胞内表达和胞外释放明显增强的一种表型，是衰老细胞的一个重要生化和细胞学特征。sasp包括促炎细胞因子(如il-1α、il-1β、il-6和il-8)，生长因子(如hgf、tgf-β和gm-csf)，趋化因子(如cxcl1/3和cxcl10)和基质重塑酶(如mmp1、mmp3)等，sasp的构成成分诱导出的不同的生物学活性表明它与其他细胞作用并构成一个特殊的多配基-多受体信号机制调节组织局部微环境，并具有导致或加剧衰老相关疾病包括癌症等恶性病理现象的多重潜力。
4、癌细胞的一个典型特征是能够重编程能量代谢以促进其扩增和生存，而增强的线粒体功能则在肿瘤进展中起着重要作用。衰老细胞的主要特征之一是它们保持代谢活跃，并合成大量的sasp因子，能够局部或系统地影响宿主微环境中其它细胞。以前关于细胞衰老代谢的研究表明，衰老过程中葡萄糖消耗和乳酸生成水平都会升高。葡萄糖是衰老细胞的主要能量来源，但是，间质来源和非癌实体的葡萄糖的代谢特征以及这种代谢谱对周围组织稳态的影响仍然很大程度上并不清楚。因此，从代谢角度揭示细胞衰老及其特定表型发生发展的调控机制，从进而揭示具有靶向价值的关键分子及其信号通路，是衰老生物学和老年医学的一个新兴方向，亟需深入开展相关探索，为临床医学提供重要科学依据和潜在的干预措施。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase4,pdk4)作为细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的应用。本发明揭示了pdk4作为细胞衰老干预以及肿瘤化疗药物耐药性干预的新型靶点，以其作为靶标，可开发抑制肿瘤化疗耐药性的药物、抑制或延缓衰老相关分泌表型的药物，也可以将以其作为靶标的药物与肿瘤化疗药物联用，以及根据该靶标和机制对相关疾病或症状进行诊断、预后评估。
2、在本发明的第一方面，提供一种pdk4的下调剂的应用，用于：
3、制备抑制肿瘤耐药性的组合物；
4、与化疗药物联合使用，制备抑制肿瘤、或抑制肿瘤耐药性的组合物；或
5、制备抑制或延缓衰老相关分泌表型的组合物。
6、在本发明的第二方面，提供一种pdk4的应用，用于：
7、作为抑制肿瘤耐药性、或筛选抑制肿瘤耐药性药物的靶标(或标志物)；
8、作为抑制或延缓衰老相关分泌表型、或筛选抑制或延缓衰老相关分泌表型药物的靶标(或标志物)；
9、作为对肿瘤耐药性进行诊断或预后的标志物；或
10、制备肿瘤耐药性诊断或预后的诊断试剂。
11、在本发明的第三方面，提供一种用于抑制肿瘤的组合物、药物组合物或药盒，包括：pdk4的下调剂，以及化疗药物。
12、在一种或多种实施方式中，所述的肿瘤为具有耐药性的肿瘤；较佳地包括在基因毒药物处理后产生耐药性或肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤；更佳地包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌。
13、在一种或多种实施方式中，所述衰老相关分泌表型为dna损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的dna损伤为化疗药物造成的dna损伤；更佳地，所述化疗药物包括基因毒药物。
14、在一种或多种实施方式中，所述衰老相关分泌表型为高代谢表型；较佳地，所述高代谢表型为糖酵解、和/或tca活性、和/或atp促进氧化磷酸化增强；更佳地，所述高代谢表型为柠檬酸/丙酮酸的比值增加，代谢产物(较佳地包括：二羟丙酮、3-磷酸-甘油醛、丙酮酸、丙氨酸、乳酸、3-磷酸甘油酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、谷氨酸、琥珀酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸)的含量上升，代谢过程中的酶(较佳地包括：glut1、hk2、ldha、idh2、idh3、ogdh、cs)的表达或活性增加；线粒体超微结构改变，释放到胞外的丙酮酸和乳酸的生成量、以及细胞外酸化率(ecar)显著增加，耗氧率(ocr)上升，以及atp产量、基础呼吸率、最大呼吸率升高。
15、在一种或多种实施方式中，所述pdk4的下调剂包括下调pdk4活性的物质或下调pdk4的表达水平、稳定性或减少其有效作用时间的物质；
16、较佳地，所述下调剂包括：针对pdk4的化学小分子拮抗剂或抑制剂，敲除或沉默pdk4的试剂，蛋白酶体；
17、更佳地，所述pdk4的下调剂是pdk4-in；或所述敲除或沉默pdk4的试剂包括：特异性干扰pdk4的编码基因表达的干扰分子，针对pdk4的crispr基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将pdk4进行功能丧失性突变。
18、在一种或多种实施方式中，所述的化疗药物为在给药后发生肿瘤耐药的化疗药物；较佳地包括基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，长春碱，紫杉萜，紫杉醇，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨或5-氟尿嘧啶。
19、在一种或多种实施方式中，所述pdk4的下调剂和化疗药物按照重量比为：1:1～200；较佳地为1:2～100；更佳地为1:5～50。
20、在一种或多种实施方式中，所述pdk4的下调剂的终浓度为：0.1～100μm；较佳地0.5～50μm；更佳地1～10μm；或所述的化疗药物的终浓度为：0.01～100μm；较佳地0.05～80μm；更佳地0.1～50μm。
21、在一种或多种实施方式中，当所述的化疗药物是米托蒽醌时，所述的化疗药物的终浓度为0.01～10μm、0.05～5μm、0.1～1μm；例如0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm；pdk4的下调剂的终浓度为：0.1～100μm、0.5～50μm、1～10μm；例如1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm。
22、在一种或多种实施方式中，所述给药剂量是给予小鼠的剂量，本领域技术人员知晓，可以根据给予小鼠的剂量换算成给予其他动物或人的剂量。
23、在一种或多种实施方式中，所述pdk4的下调剂(如pdk4-in)的给药剂量为：1～100mg/kg；较佳地2～50mg/kg；更佳地5～20mg/kg；并且所述的化疗药物的给药剂量为：0.01～10mg/kg；较佳地0.05～5mg/kg；更佳地0.1～1mg/kg。
24、在一种或多种具体的实施方式中，所述的化疗药物是米托蒽醌(mit)的给药剂量为：0.01～10mg/kg、0.05～5mg/kg、0.1～1mg/kg；例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg。
25、在一种或多种具体的实施方式中，所述的化疗药物是阿霉素(dox)的给药剂量为：0.01～10mg/kg、0.05～5mg/kg、0.05～3mg/kg、0.1～2mg/kg、0.1～1mg/kg；例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg。
26、在一种或多种具体的实施方式中，所述的化疗药物是紫杉萜(dtx)的给药剂量为：0.01～10mg/kg、0.05～5mg/kg、0.05～3mg/kg、0.1～2mg/kg、0.1～1mg/kg；例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg。
27、在一种或多种具体的实施方式中，所述的化疗药物是紫杉醇(ptx)的给药剂量为：0.01～10mg/kg、0.05～5mg/kg、0.05～3mg/kg、0.1～2mg/kg、0.1～1mg/kg；例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg。
28、在本发明的第四方面，提供一种制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，包括：将pdk4的下调剂与化疗药物混合；或，将pdk4的下调剂与化疗药物置于同一药盒中。
29、在本发明的第五方面，提供一种筛选促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：
30、(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞和基质细胞；
31、(2)利用化疗药物处理(1)的体系，诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型；
32、(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用；
33、若其能特异性靶向清除肿瘤微环境中衰老细胞和/或促进基质细胞(为非衰老的细胞)生长(提高基质细胞培增速度)，则其是促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质；
34、较佳地，
35、步骤(2)中，还包括：在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型(如高代谢表型)之前、之时或之后，以pdk4的下调剂进行处理；
36、和/或，步骤(3)中，还包括：若所述候选物质在统计学上能够促进pdk4或其编码基因的下调剂清除肿瘤微环境中衰老细胞和/或促进基质细胞生长，则该候选物质是可与pdk4或其编码基因的下调剂联用、抑制肿瘤的潜在物质。
37、在本发明的第六方面，提供一种筛选降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：
38、(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达pdk4；和
39、(2)检测所述体系中pdk4的表达或活性；若所述候选物质在统计学上能够下调pdk4的表达或活性(显著下调，如下调10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等，或使之不表达或没有活性)，则该候选物质是降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质；
40、较佳地，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或
41、步骤(2)包括：检测所述体系中pdk4的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上能够下调pdk4的表达或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。
42、在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对pdk4或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，小分子化合物等。
43、在一种或多种实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(如表达pdk4的细胞或细胞培养物)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
44、在一种或多种实施方式中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型有用的物质。
45、在本发明的第七方面，提供特异性识别或扩增pdk4的试剂、或特异性识别或检测乳酸的试剂的用途，用于制备对肿瘤耐药性进行诊断或预后的诊断试剂或试剂盒。
46、在一种或多种实施方式中，所述的诊断试剂包括：特异性结合pdk4蛋白的结合分子；特异性扩增pdk4基因的引物；特异性识别pdk4基因的探针；特异性识别pdk4基因的芯片；特异性结合乳酸的结合分子；特异性识别乳酸的探针；或特异性监测(检测)乳酸水平的酶。
47、在本发明的第八方面，提供一种pdk4的下调剂在制备药物或制剂中的用途，所述药物或制剂用于：下调衰老相关分泌表型、下调高代谢表型、降低糖酵解水平、降低tca活性、抑制atp促进氧化磷酸化、降低代谢产物的含量、抑制代谢过程中的酶的表达或活性、抑制代谢产物释放到细胞外、抑制atp产量、降低呼吸率、延缓衰老、延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担、预防、缓解和治疗受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病、降低对癌症疗法的耐药性、或增强能诱导细胞衰老的试剂的功效；
48、较佳地，所述呼吸率包括：基础呼吸率、最大呼吸率；
49、和/或，所述代谢产物包括：二羟丙酮、3-磷酸-甘油醛、丙酮酸、丙氨酸、乳酸、3-磷酸甘油酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、谷氨酸、琥珀酸、琥珀酸、富马酸或苹果酸；
50、和/或，所述代谢过程中的酶包括：glut1、hk2、ldha、idh2、idh3、ogdh或cs。
51、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
1.pdk4的下调剂的应用，用于：
2.pdk4的应用，用于：
3.一种用于抑制肿瘤的组合物、药物组合物或药盒，包括：pdk4的下调剂，以及化疗药物。
4.如权利要求1或2所述的应用，或如权利要求3所述的组合物、药物组合物或药盒，其特征在于，所述的肿瘤为具有耐药性的肿瘤；较佳地包括在基因毒药物处理后产生耐药性或肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤；更佳地包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌。
5.如权利要求4所述，其特征在于，所述衰老相关分泌表型为dna损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的dna损伤为化疗药物造成的dna损伤；更佳地，所述化疗药物包括基因毒药物；
6.如权利要求1或3所述，其特征在于，所述pdk4的下调剂包括下调pdk4活性的物质或下调pdk4的表达水平、稳定性或减少其有效作用时间的物质；
7.如权利要求1或3所述，其特征在于，所述的化疗药物为在给药后发生肿瘤耐药的化疗药物；较佳地包括基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，长春碱，紫杉萜，紫杉醇，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨或5-氟尿嘧啶。
8.如权利要求3所述的药物组合物或药盒，其特征在于，所述pdk4的下调剂和化疗药物按照重量比为：1:1～200；较佳地为1:2～100；更佳地为1:5～50。
9.如权利要求3所述的药物组合物或药盒，其特征在于，所述pdk4的下调剂的终浓度为：0.1～100μm；较佳地0.5～50μm；更佳地1～10μm；或所述的化疗药物的终浓度为：0.01～100μm；较佳地0.05～80μm；更佳地0.1～50μm。
10.一种制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，包括：将pdk4的下调剂与化疗药物混合；或，将pdk4的下调剂与化疗药物置于同一药盒中。
11.一种筛选促进化疗药物抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括：
12.一种筛选降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：
13.特异性识别或扩增pdk4的试剂、或特异性识别或检测乳酸的试剂的用途，用于制备对肿瘤耐药性进行诊断或预后的诊断试剂或试剂盒。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂包括：特异性结合pdk4蛋白的结合分子；特异性扩增pdk4基因的引物；特异性识别pdk4基因的探针；特异性识别pdk4基因的芯片；特异性结合乳酸的结合分子；特异性识别乳酸的探针；或特异性监测乳酸水平的酶。
15.pdk4的下调剂在制备药物或制剂中的用途，所述药物或制剂用于：下调衰老相关分泌表型、下调高代谢表型、降低糖酵解水平、降低tca活性、抑制atp促进氧化磷酸化、降低代谢产物的含量、抑制代谢过程中的酶的表达或活性、抑制代谢产物释放到细胞外、抑制atp产量、降低呼吸率、延缓衰老、延长对象寿命、减少对象的年龄相关疾病负担、预防、缓解和治疗受益于非增殖态细胞减少或消除的疾病、降低对癌症疗法的耐药性、或增强能诱导细胞衰老的试剂的功效；
