本公开总体上涉及基因编辑方法，其包括使用电穿孔增强病毒转导至细胞中，具体地涉及编辑基因的方法，其包括敲除感兴趣的基因并经由共电穿孔插入新基因和/或病毒载体。本公开还涉及使用该方法制备的修饰细胞，以及将治疗剂递送至包含修饰细胞的患者的方法。
背景技术：
1、电穿孔是将核酸加载到细胞中以实现加载细胞的转染的方法。电穿孔、电转染和电加载的术语在文献中可以互换使用，分别强调该技术的一般含义、转基因表达和分子转移到细胞质中。以下将这种转染细胞的方法称为电加载，即使用电穿孔，不使用转染试剂或所装载的核酸的基于生物学的包装，例如病毒载体或病毒样颗粒，仅依靠施加在细胞上的瞬态电场来促进细胞的加载的方法。
2、在电穿孔中，核转染是一种特殊的转染试剂，可帮助将细胞质中的dna转移至细胞核。据报道，核转染可使用经过专有核转染剂处理的质粒dna转染静息t细胞和nk细胞(maasho et al.,2004)。还表明了嵌合受体的静息t细胞核转染可以导致特异性靶细胞杀伤(finney,et al,2004)。
3、此外，还可以向细胞加载mrna，这对于静息细胞和将被输注到患者体内的细胞可能是有益的。首先，相对于加载质粒dna，mrna(尤其是通过电加载加载时)细胞毒性最小，对于静息细胞(例如静息nk细胞和外周血单核细胞(pbmc)细胞)的电加载尤其如此。此外，由于mrna不需要进入细胞核来表达，因此静息细胞很容易表达加载的mrna。此外，由于mrna不需要被转运到细胞核，或者被转录或加工，所以它可以在进入细胞的细胞质后基本上可以立即开始翻译。这使得mrna编码的基因能够快速表达。此外，mrna不会复制或修饰细胞的可遗传遗传物质，并且mrna制剂通常含有单个蛋白质编码序列，该序列编码人们希望在加载的细胞中表达的蛋白质。关于mrna电加载的各种研究已有报道(landi et al.,2007；vande parre et al.2005；rabinovich et al.2006；zhao et al.,2006)。
4、基因编辑程序，即成簇规则间隔短回文重复序列(“crispr”)，能够选择靶标位置的基因，并通过移除、编辑或改变dna的部分来精确编辑该基因。crispr可用于敲除感兴趣的基因并插入新的基因和/或病毒载体。从历史上看，执行插入的时间各不相同，但总是在敲除完成后执行插入。文献表明，如果在接近基因敲除的时间执行，病毒载体插入会更有效。
5、电穿孔破坏细胞中的所有磷脂膜，从而可以轻松进入细胞内部(包括细胞核)。科学家面临的技术问题是切割dna后何时执行转导，以最大限度地提高转导的效率和功效。
6、转导效率一直是严重缺陷，导致许多项目由于治疗效力差和缺乏精简的制备流程而被推迟或终止。电穿孔比将病毒添加到细胞培养物中的标准转导更快。barlett etal.j.virol.2000mar；74(6):2777-2785。目前的电穿孔方法在电穿孔之前或之后添加病毒载体，而不是一起添加。经由aav转导进入细胞核有速率限制的，引入ko后引入ki会对细胞造成压力，从而降低活力。
7、本公开寻求通过同时共转染敲除和敲入的方法以克服现有技术中的一个或多个前述缺陷，以在提高效率的同时缩短程序的时长。所要求保护的方法提供了更加精简的制备流程，在该流程中步骤更少并且对细胞的操作更少。它还可以增加治疗效力。
8、发明概述
9、在一个实施方案中，公开了使用电穿孔增强病毒转导至细胞中的方法，包括：选择一个或多个待修饰的细胞；收获待修饰的细胞；浓缩待修饰的细胞；将待修饰的细胞与病毒、病毒载体或病毒样颗粒组合以形成混合物；同时对混合物进行电穿孔和转导，以将病毒、病毒载体或病毒样颗粒插入其中；并形成一个或多个共电穿孔细胞。
10、在一个实施方案中，描述了基因编辑方法，该方法包括：选择待编辑的细胞或细胞系；收获细胞或细胞系；通过使用离心机或任何细胞浓缩仪器来浓缩细胞或细胞系；将细胞或细胞系与cas9-sgrna样品和编码期望蛋白质或肽的病毒载体组合以形成混合物；并对混合物进行同时转染和转导。所公开的方法同时导致cas9-sgrna样品编辑、移除或改变来自细胞或细胞系的感兴趣的基因，并将载体插入到基因的编辑、移除或改变的位置。
11、在一个实施方案中，还公开了通过所公开的方法制备的修饰细胞。修饰的细胞可以衍生自血液、组织液和组织。所公开的方法中使用的细胞的非限制性实例包括衍生自骨髓、外周血、或脐带血、或任何其他正常或受疾病影响的组织的细胞。
12、在一个实施方案中，将重悬于缓冲液中的浓缩细胞与病毒混合，插入处理组件中，并进行电穿孔。在经由转导进行ko随后进行ki的情况下，将rnp+病毒(ko)与病毒(ki)混合，放入处理组件中并进行电穿孔。
13、除了上面讨论的主题之外，本公开还包括许多其他示例性特征，例如下文中解释的那些。应当理解，前面和下面的描述都仅是示例性的。
技术实现思路
1.使用电穿孔增强病毒转导至细胞的方法，所述方法包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述病毒、病毒载体或病毒样颗粒与基因编辑剂共电穿孔。
3.权利要求2所述的方法，其中所述基因编辑剂选自crispr cas-9、rna、质粒、mega-tals、基因写入、dnasei、benzonase、核酸外切酶i、核酸外切酶iii、绿豆核酸酶、核酸酶bal31、rnase i、51核酸酶、lambda核酸外切酶、recj、t7核酸外切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录活化剂样效应核酸酶和位点特异性核酸酶。
4.权利要求1所述的方法，其中大于20％的所述共电穿孔的细胞表达期望的蛋白质或肽。
5.权利要求4所述的方法，其中25％-35％的所述共电穿孔细胞表达所述期望的蛋白质或肽。
6.权利要求1所述的方法，其中与所述待修饰的细胞相比，所述共电穿孔的细胞的活力下降范围为25％-50％。
7.权利要求1所述的方法，其中与所述待修饰的细胞相比，所述共电穿孔的细胞的活力下降不超过20％。
8.权利要求1所述的方法，其中与所述待修饰的细胞相比，所述共电穿孔的细胞的活力下降不超过10％。
9.权利要求1所述的方法，其中与所述待修饰的细胞相比，所述共电穿孔的细胞的活力下降不超过5％。
10.权利要求1所述的方法，其中所述待修饰的细胞在1×105至1×1011范围的细胞群内。
11.权利要求1所述的方法，其中所述待修饰的细胞被浓缩至10μl至1l范围的体积。
12.权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述共电穿孔的细胞施用于患者的步骤。
13.权利要求1所述的方法，其中浓缩所述待修饰的细胞的步骤是用离心机或任何细胞浓缩装置进行的。
14.权利要求1所述的方法，其中所述待修饰的细胞衍生自血液、间质液和组织。
15.权利要求14所述的方法，其中所述待修饰的细胞衍生自骨髓、外周血、或脐带血、或任何其他正常或受疾病影响的组织。
16.权利要求14所述的方法，其中所述待修饰的细胞衍生自全外周血单核细胞(pbmc)或全脐带血单核细胞(cbmc)。
17.权利要求16所述的方法，其中所述pbmc包含一个或多个αβtcr+t细胞、γδtcr+t细胞、nk细胞、不变nkt细胞、b细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、造血祖细胞、间充质祖细胞和基质细胞。
18.权利要求1所述的方法，其中浓缩所述待修饰的细胞产生浓缩的细胞，所述浓缩的细胞在与所述病毒、病毒载体或病毒样颗粒组合之前重悬于缓冲液中。
19.通过权利要求1所述的方法制备的修饰的细胞。
20.权利要求19所述的修饰的细胞，其中所述待修饰的细胞衍生自血液、间质液和组织。
21.权利要求19所述的修饰的细胞，其中所述待修饰的细胞衍生自骨髓、外周血、或脐带血、或任何其他正常或受疾病影响的组织。
22.权利要求21所述的修饰的细胞，其中所述外周血和脐带血分别包含外周血单核细胞(pbmc)和全脐带血单核细胞(cbmc)。
23.权利要求22所述的修饰的细胞，其中所述pbmc是αβtcr+t细胞、γδtcr+t细胞、nk细胞、不变nkt细胞、b细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、粒细胞、造血祖细胞、间充质祖细胞、基质细胞及其组合。
