本技术涉及生物检测，尤其是涉及一种完全区分dna和rna的纯化方法及rna纯化试剂盒。
背景技术：
1、dna、rna和蛋白质构成了生命的三大基本物质。dna转录为rna，而rna翻译合成蛋白质，这一过程是生物体内遗传信息传递和生物功能实现的基础，也是基础科学研究的主要研究对象。核酸提取是科学研究不可或缺的关键步骤，为遗传学、分子生物学和基因组学提供基础材料。此外，核酸提取在医学临床中广泛应用，是疾病分子诊断的重要基础步骤。精确高效的核酸提取是确保分子诊断实验顺利进行的不可或缺的“第一步”，为医学研究提供了可靠的实验基础。
2、1990年，boom等人首次发明了硅胶柱法用于核酸提取的方法，研究发现，硅胶对核酸有亲和性，可以通过调整盐浓度和ph来控制核酸在硅胶表面的结合和解离进而实现核酸的纯化和分离。基于硅胶法提取核酸的发现是分子生物学领域的一项重要创新，其基本过程主要分为细胞裂解，硅胶结合，漂洗，核酸洗脱等过程，随着基因检测、个性化给药、产前诊断等技术的普及，生物行业对高通量、自动化的需求日益增长。相较于传统核酸提取方法，硅胶法提取由于具有简单高效，不使用酚和氯仿等有毒试剂，高产量高纯度，自动化高通量等明显优势，使其成为分子生物学研究中广泛应用的核酸提取方法。
3、正常情况下，核酸表面被一层由水分子形成的亲水膜所覆盖，以维持其水溶性。硅胶与核酸在高浓度盐离子和较低ph(≤7.0)的情况下，通过由盐离子形成的阳离子桥效应（硅胶膜和核酸均带有负电荷），核酸能够与硅胶膜有效地发生结合，通过漂洗和洗脱，从而实现核酸的分离和纯化，而蛋白质、代谢产物和其他污染物不能结合进而能实现核酸的分离纯化。目前认为硅胶法是用于dna/rna纯化和分离的有效方法，但该方法本身不能完全区分dna和rna。有研究认为dna在高盐浓度下结合，而rna在低盐浓度下结合，通过洗脱过程盐浓度的控制，可以大致纯化dna和rna，但实际两者很难完全分离，因而迫切需要发现新的原理和条件方法来解决上述问题。通常采取额外的dna酶（dnaseⅰ）或者rna酶（rnasea）消化来去除相应的dna和rna污染从而实现rna和dna的分离纯化，而使用酶消化需要一定的缓冲体系，在纯水及极端溶液如trizol等含酚类溶液，或者强细胞裂解液ripa溶液中，酶的活性低下甚至失活，需要进一步纯化才能进行酶的消化，同时酶消化需要一定的消化时长，增加了整个核酸提取过程的时长，并且仍然无法排除酶消化后相应的核酸碎片的污染，因此有些样品可能需要多次核酸纯化才能完全去除污染，不利于核酸提取的自动化和高通量应用的发展。
技术实现思路
1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种完全区分dna和rna的纯化方法及rna纯化试剂盒。
2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：
3、第一方面，本技术提供了一种完全区分dna和rna的纯化方法，包括以下步骤：
4、s1、在测试样品中加入dna和rna，同时加入rna去污染液混匀，获得混匀液；
5、s2、取步骤s1获得的混匀液加入硅胶柱，室温离心，然后用dna纯化试剂盒纯化，获得dna样品，质检；
6、s3、收集流穿液，向流穿液中加入乙醇，然后加入硅胶柱，向硅胶柱加入rna漂洗液漂洗，获得rna样品，质检；
7、所述rna去污染液包括质量浓度为1~4m的异硫氰酸胍或者盐酸胍、和质量浓度为0.1m~1m的tris-hcl，所述rna去污染液的ph≥6.8。
8、在本技术的技术方案中，发现在一定浓度的rna去污染液（1-4m异硫氰酸胍或者盐酸胍、和质量浓度为0.1m~1m的tris-hcl，ph≥6.8）的条件下，发现dna和rna与硅胶柱的结合存在明显的拐点，找到了硅胶提取方法完全区分dna和rna的纯化方式。
9、本技术通过大量测试硅胶与dna和rna在不同条件下的结合能力，发现在一定条件下，dna和rna与硅胶结合的理化性质是不一样的，通过这样的理化性质，完全可以把dna和rna区分；将dna和rna经过rna去污染液（1-4m异硫氰酸胍/盐酸胍，0.1m-1m tris-hcl，ph≥6.8）即可区分dna，在这个范围内dna与硅胶结合，而rna不能与硅胶结合而存在于rna流穿液中；然后向流穿液中加入乙醇，rna又能与硅胶结合，因此，找到了硅胶高效完全分离dna和rna的纯化方法，有望兼容高通量自动化rna提取方案的开发。
10、本技术还测试了在无缓冲液体系，极端缓冲液体系中dna和rna的分离效果，仅需要30s即可实现dna污染去除。除去dna污染之后还进行了rna纯化，使其od值260/280 260/230达到了下游兼容核酸质谱检测和高通量测序的最高纯度标准，整个流程仅花费4.5min。
11、采用本技术的纯化方法还可以与其它公司商用rna纯化试剂盒兼容，考虑到硅胶核酸提取方式的普及性，该原理和发现对于推动核酸分离纯化领域的发展和自动化高通量的科研探索和大规模流行病学的临床检测及rna疫苗开发具有重要作用和意义。
12、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述rna去污染液的ph为6.8~10。
13、盐浓度和ph被认为是核酸（dna和rna）硅胶提取核心的两个因素。但是目前不管是dna硅胶提取还是rna硅胶提取基本都在ph小于7的条件下进行（现实情况是ph小于6.8，dna和rna都能与硅胶结合，目前市面上现有所有的商用及实验条件不管分离dna还是分离rna都是用ph小于7的条件，并且认为dna/rna与硅胶的结合在结合阶段是无法区分的），本技术知道硅胶提取需要一定盐浓度（离液盐）必须在有盐的浓度下但这个盐浓度范围较广，同时必须要一定ph，通常认为ph＜7，而目前并不清楚当溶液ph偏离人们认知的合理范围时对dna和rna提取有何影响。
14、本技术发现当ph为6.8 /7.4/8/9/10时，硅胶柱与dna和rna的结合能力完全不同，dna和rna经过rna去污染液（1-4m异硫氰酸胍/盐酸胍，0.1m-1m tris-hcl，ph≥6.8），dna能和硅胶结合，而不与rna结合，所以rna存在于流穿液中，但是本技术又发现了这些流穿液不管ph为多少，只要与等体积乙醇混合，又能重新被硅胶柱高效吸附。通过ph能使dna和rna与硅胶区分结合，这一发现和原理从未被报道；同时不同ph值下rna流穿液通过等体积乙醇混合都能被硅胶柱高效吸附的现象也从未被发现，该原理的发现可应用于自动化的核酸提取方式的开发，因此本技术开发了高效的去dna提rna的纯化方法，整个流程只需4.5min。
15、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述测试样品和rna去污染液的体积比为1：（1.5~4）。
16、采用上述体积比的测试样品和rna去污染液，可以保证盐浓度和ph值，有利于完全纯化dna和rna。
17、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述dna和rna的质量比为（1~10）：1。
18、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述流穿液和乙醇的体积比为1:（1~2），优选为1:1。
19、采用上述体积比的流穿液和乙醇，rna能与硅胶结合，可以更好的纯化rna。
20、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述rna漂洗液包括rna漂洗液i和rna漂洗液ii；
21、所述rna漂洗液i包括质量浓度为1~4m的盐酸胍和质量浓度为50%-70%的乙醇；
22、所述rna漂洗液ii包括质量浓度为50%-70%乙醇和质量浓度为0.1~0.5m的氯化钠。
23、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述测试样品包括无缓冲液体系或极端缓冲液体系；
24、所述无缓冲液体系包括纯水；所述极端缓冲液体系包括含酚类溶液、trizol氯仿萃取溶液、强细胞裂解液ripa溶液中的至少一种。
25、trizol氯仿萃取溶液组分主要含有十二烷基肌氨酸钠（sds），醋酸钠（ph=4-5.0），异硫氰酸胍，2-巯基乙醇，少量酚等；强细胞裂解液ripa溶液的成分为50mm tris-hcl(ph7.4)，150mm nacl，1% triton x-100，1%脱氧胆酸钠，0.1% sds。这些液体都是细胞裂解常规溶液，主要包含强烈的蛋白变性剂，如sds，胍盐，triton x-100，2-巯基乙醇，脱氧胆酸钠等以便于细胞充分裂解。dnasei是酶是蛋白质，酶发挥作用需要合适的缓冲液体系，合适的ph值和必需的二价金属离子，dnasei酶反应buffer为：100 mm tris-hcl (ph7.5)，25 mmmgcl2，1 mm cacl2。
26、而trizol氯仿萃取溶液ph值小于5并且含大量蛋白变性剂，而ripa buffer同样含有强烈蛋白变性剂，在这样的体系环境中，dnasei处于失活变性状态，几乎是所有酶工作的极端环境。酶无法在这些液体中直接使用，无法直接消化rna样品中的dna污染，通常需要纯化将这些变性组分去掉，然后提供dnasei缓冲溶液进行酶切反应，37度30min左右，然后需要再进一步纯化将酶和buffer去掉才能得到较为纯净的rna，过程繁琐复杂周期长损失大rna也容易降解。而本技术的去除原理可以直接在这些酶不能工作的极端buffer（trizol氯仿萃取溶液和ripa细胞裂解液）中使用，仅需30s可分离dna和rna，同时后续只需要4min的rna纯化流程，即可获得高纯度高质量兼容高通量测序的rna。
27、本技术提供了快速高效率的完全区分dna和rna的纯化方法，不需要额外的纯化步骤并且利用硅胶吸附的高效性，整个分离纯化流程在4.5min左右（应该是目前能做到的最简易高效的步骤，耗时最短的方法），因而非常适合用于自动化高通量核酸提取方案的开发，也是大趋势所在（满足和适应自动化高通量的科研探索和大规模流行病学的临床检测及rna疫苗开发需求）。
28、作为本技术所述完全区分dna和rna的纯化方法的优选实施方式，所述步骤s2离心的速度为12000g，离心的时间为30s~180s，优选为30s。
29、本技术发现dna和rna与硅胶结合的区分点，通过区分点的条件快速去除dna的污染，本技术加入的rna和dna同时存在于水相中。而面对rna和dna同时存在于水相中的情况，很多技术都无法将rna样品中污染的dna去除，因为它使用的原理都是使dna不溶于水相而通过离心或者过滤与rna分离；本技术可以在水中直接添加dna和rna，然后将rna去除dna纯化出来，采用该方法能直接高效不依赖于酶消化或割胶分离（步骤繁琐时间长损失大易降解），能把水相中的dna和rna在30s内进行分离。
30、本技术的纯化方法还可以进一步提升rna样品中dna污染的去除效果，部分技术可能受到样品环境的影响，假若细胞裂解后dna还是有部分溶于水相，那么该方法提取的rna便存在dna污染，通常需要通过dnasei进一步纯化去除，而酶消化需要温度需要缓冲体系需要实验时间，而本技术的纯化方法只需要30s的分离，并不依赖于dnasei。进一步本技术在纯水，在极端缓冲溶液（trizol氯仿萃取溶液，ripa细胞裂解液）对该原理的应用，都是在dna与rna同时存在于水相中的情况进行应用，另一方面由于硅胶吸附的便捷性，本技术建立相应纯化系统，进一步把流程缩短到4.5min之内。
31、有部分技术的纯化方式依然采用传统的乙醇沉淀方式，乙醇沉淀时间至少大于15min或沉淀过夜，还不包括后续的洗涤和溶解，对于微量1微克rna则还需添加额外载体指示剂否则无法观测到沉淀而导致实验失败。而本技术的纯化方法由于发现了rna与等体积乙醇混合能被硅胶吸附的原理建立相应的rna纯化方法，仅需4min即可获得高纯度高质量rna，其纯度（od260/280 od260/230）兼容高通量测序要求。并且对于微量rna无需添加任何载体指示剂，实验流程步骤时长短，适合自动化高通量的应用。
32、本技术还提供了一种rna纯化试剂盒，所述rna纯化试剂盒包括rna去污染液、rna漂洗液i和rna漂洗液ii；
33、所述rna去污染液包括质量浓度为1~4m异硫氰酸胍或盐酸胍、质量浓度为0.1m-1m的tris-hcl；所述rna去污染液的ph≥6.8；
34、所述rna漂洗液i包括质量浓度为1~4m的盐酸胍和质量浓度为50%-70%的乙醇；
35、所述rna漂洗液ii包括质量浓度为50%-70%乙醇和质量浓度为0.1~0.5m的氯化钠。
36、本技术还建立了不依赖于dna酶消化的快速分离高纯度rna纯化试剂盒，纯化时间仅需4min，rna的回收率高达83%以上，其下游兼容核酸质谱及高通量建库测序。
37、本技术还提供了上述rna纯化试剂盒在纯化含有dna污染的rna样品中的应用。
38、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
39、本技术提供了一种完全区分dna和rna的纯化方法及rna纯化试剂盒，本技术发现在一定浓度的rna去污染液（1-4m异硫氰酸胍或者盐酸胍、和质量浓度为0.1m~1m的tris-hcl，ph≥6.8）的条件下，发现dna和rna与硅胶柱的结合存在明显的拐点，找到了硅胶提取方法完全区分dna和rna的纯化方式。本技术还测试了在无缓冲液体系，极端缓冲液体系中dna和rna的分离效果，仅需要30s即可实现dna污染去除。采用本技术的纯化方法还可以与其它公司商用rna纯化试剂盒兼容，考虑到硅胶核酸提取方式的普及性，该原理和发现对于推动核酸分离纯化领域的发展和自动化高通量的科研探索和大规模流行病学的临床检测及rna疫苗开发具有重要作用和意义。
1.一种完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述rna去污染液的ph为6.8~10。
3.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述测试样品和rna去污染液的体积比为1：（1.5~4）。
4.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述dna和rna的质量比为（1~10）：1。
5.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述流穿液和乙醇的体积比为1:（1~2）。
6.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述rna漂洗液包括rna漂洗液i和rna漂洗液ii；
7.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述测试样品包括无缓冲液体系或极端缓冲液体系；
8.如权利要求1所述的完全区分dna和rna的纯化方法，其特征在于，所述步骤s2离心的速度为12000g，离心的时间为30s~180s。
9.一种rna纯化试剂盒，其特征在于，所述rna纯化试剂盒包括rna去污染液、rna漂洗液i和rna漂洗液ii；
10.如权利要求9所述的rna纯化试剂盒在纯化含有dna污染的rna样品中的应用。
