本发明属于合成生物学、食品和微生物发酵领域，涉及一株无需抗生素高产乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)整合型工程菌的构建及其应用。
背景技术：
1、母乳寡糖(human milk oligosaccharides， hmos)是人类母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分。hmos可以被肠道中的有益微生物菌群利用，具有促进双歧杆菌的增殖、阻碍病原体的粘附、调节肠道上皮细胞应答、调节肠道菌群、增强人体免疫力等功能。
2、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)是母乳中一种主要的中性非岩藻糖基hmos，约占总hmos的2～7%。分子式为c26h45no21。
3、2023年10月7日，正式批准lnnt作为食品营养强化剂应用于婴幼儿配方食品、儿童调制乳粉及特殊医学用途婴儿配方食品中。
4、lnnt的生产方法主要有以下4种：
5、（1）生物提取法。生物体中lnnt的天然含量很低，且从生物体中提取lnnt的工艺复杂。
6、（2）化学合成法。化学合成法所采用的底物昂贵、反应过程复杂、副产物多，可能用到有毒试剂，不环保。
7、（3）体外酶法。酶的底物昂贵，体外酶活和酶的特异性受限，lnnt的产量较低。
8、（4）微生物发酵法。微生物发酵法可以利用微生物自身的代谢能力将廉价的原料转化为lnnt，不需要进行酶的提取纯化，成本较低，且高效环保，具有极大的工业化生产lnnt潜力。专利cn 113136357 b利用改造后的重组大肠杆菌bl21（de3）来发酵生产lnnt，lnnt的产量为1.031g/l。但是，该产量仍然较低，难以满足大批量工业生产的需求。
技术实现思路
1、本发明为了克服微生物发酵法在合成lnnt时产量较低的问题，提供了无需抗生素且高产lnnt的整合型工程菌及其构建方法和应用。
2、本文的重组大肠埃希氏菌（ escherichia coli）已经于2024年1月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101),保藏号为cgmcc no. 29790。
3、在一方面，提供了一种重组大肠杆菌，其含有编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的外源lgta基因；所述lgta基因编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含与seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的氨基酸序列。
4、在一个实施方案中，lgta基因包含与seq id no:19的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，lgta基因包含seq id no:19的核苷酸序列。
5、在一个实施方案中，重组大肠杆菌含有编码β-1,4-半乳糖基转移酶的galt基因和编码尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶的gale基因中的一种以上。
6、在一个实施方案中，所述galt基因编码β-1,4-半乳糖基转移酶，所述β-1,4-半乳糖基转移酶包含与seq id no: 1的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述β-1,4-半乳糖基转移酶包含seq id no: 1的氨基酸序列。
7、在一个实施方案中，所述gale基因编码尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶，所述尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶包含与seq id no: 3的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶包含seq id no: 3的氨基酸序列。
8、在一个实施方案中，所述galt基因包含与seq id no:18的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述galt基因包含seq id no:18的核苷酸序列。
9、在一个实施方案中，所述gale基因包含与seq id no:20的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述gale基因包含seq id no:20的核苷酸序列。
10、在一个实施方案中，所述lgta基因和所述gale基因采用t7启动子。在一个实施方案中，所述galt基因采用t7启动子、tac启动子、lac uv5启动子或t23启动子，所述t23启动子包含与seq id no:22的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述t23启动子包含seq idno:22的核苷酸序列。
11、在一个实施方案中，所述gale基因、所述lgta基因和所述galt基因按照第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因的排列顺序构建于质粒载体中或者共同整合于所述重组大肠杆菌基因组一个或多个插入序列is1中。
12、在一个实施方案中，所述第一启动子为t7启动子；所述第二启动子为t7启动子、tac启动子、lac uv5启动子或t23启动子，所述t23启动子的核苷酸序列如seq id no:22所示。
13、在一个实施方案中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因构建于所述质粒载体中时，所述第一启动子为所述质粒载体自有的启动子。
14、在一个实施方案中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述重组大肠杆菌基因组中的拷贝数为20-30。在一个实施方案中，所述质粒载体选自于prsfduet1、pre57-ter或pet28a。
15、在一个实施方案中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述重组大肠杆菌基因组中的拷贝数为20、21、22、23、24、25、26、27或28。
16、在一个实施方案中，所述重组大肠杆菌为大肠杆菌bl21 (de3)菌株。
17、在一个实施方案中，所述重组大肠杆菌基因组中还含有编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的外源galf基因。
18、在一个实施方案中，所述重组大肠杆菌基因组中缺失了wcaj基因、 lacz基因、 nagb基因、 araa基因、 pfka基因、 asla基因、 wecb基因、 gltb基因和 ugd基因中的一个或多个。
19、在一个实施方案中，所述重组大肠杆菌基因组中过表达 lacy基因、 fbp基因、 glms基因和 glna基因中的一个或多个。
20、在一个实施方案中，所述galf基因编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶，所述葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶包含seq id no:5的氨基酸序列。
21、在一个实施方案中，所述 lacy基因编码β-半乳糖苷透性酶，所述β-半乳糖苷透性酶包含与seq id no:14的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述β-半乳糖苷透性酶包含seq id no:14的氨基酸序列。
22、在一个实施方案中，所述 fbp基因编码果糖-1,6-二磷酸酶1，所述果糖-1,6-二磷酸酶1包含与seq id no:15的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述果糖-1,6-二磷酸酶1包含seq id no:15的氨基酸序列。
23、在一个实施方案中，所述 glms基因编码谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶包含与seq id no:16的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶包含seq id no:16的氨基酸序列。
24、在一个实施方案中，所述 glna基因编码谷氨酰胺合成酶，所述谷氨酰胺合成酶包含与seq id no:17的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酰胺合成酶与seq idno:17的氨基酸序列。
25、在一个实施方案中，所述galf基因插入所述重组大肠杆菌基因组中缺失所述 wcaj基因的位置。
26、在一个实施方案中，所述 lacy基因插入所述重组大肠杆菌基因组中缺失所述 pfka基因的位置。
27、在一个实施方案中，所述 fbp基因插入所述重组大肠杆菌基因组中缺失所述 asla基因的位置。
28、在一个实施方案中，所述 glms基因和所述 glna基因按照第三启动子- glms基因-第三启动子- glna基因的排列顺序插入所述重组大肠杆菌基因组中缺失所述 gltb基因的位置，所述第三启动子为tet启动子。
29、在一个方面，提供了一种重组大肠杆菌，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmcc no.：29790。
30、在一个方面，提供了一种重组大肠杆菌，其在大肠杆菌bl21 (de3)菌株的基础上至少进行了如下的基因改造：δ lacz、δ nagb、δ araa、δ pfka:: lacy、δ asla:: fbp、δ wecb、δ gltb:: tet- glms- tet- glna、δ ugd、△wcaj::galf，并且t7启动子-gale基因-rbs-lgta基因-t23启动子-galt基因作为一个基因组合整体插入所述重组大肠杆菌基因组中is1位点并且其拷贝数为26；
31、 lacy基因编码氨基酸序列如seq id no:14所示的β-半乳糖苷透性酶；
32、 fbp基因编码氨基酸序列如seq id no:15所示的果糖-1,6-二磷酸酶1；
33、 glms基因编码氨基酸序列如seq id no:16所示的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶；
34、 glna基因编码氨基酸序列如seq id no:17所示的谷氨酰胺合成酶；
35、galf基因编码氨基酸序列如seq id no:5所示的葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶；
36、gale基因编码氨基酸序列如seq id no:3所示的尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶；
37、lgta基因编码氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7或seq idno:8所示的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶；
38、galt基因编码氨基酸序列如seq id no:1所示的β-1,4-半乳糖基转移酶；
39、t23启动子的核苷酸序列以seq id no:22所示。
40、在一个方面，提供了一种构建重组大肠杆菌的方法，其包括：将编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的外源lgta基因导入大肠杆菌中，所述lgta基因编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含与seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶包含seq id no:2、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的氨基酸序列。
41、在一个实施方案中，所述lgta基因包含与seq id no:19的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述lgta基因包含seq id no:19的核苷酸序列。
42、在一个实施方案中，在所述大肠杆菌中导入编码β-1,4-半乳糖基转移酶的galt基因和编码尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶的gale基因中的一种以上。
43、在一个实施方案中，所述galt基因编码β-1,4-半乳糖基转移酶，所述β-1,4-半乳糖基转移酶包含与seq id no: 1的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述β-1,4-半乳糖基转移酶包含seq id no: 1的氨基酸序列。
44、在一个实施方案中，所述gale基因编码尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶，所述尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶包含与seq id no: 3的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶包含seq id no: 3的氨基酸序列。
45、在一个实施方案中，所述galt基因包含与seq id no:18的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述galt基因包含seq id no:18的核苷酸序列。
46、在一个实施方案中，所述gale基因包含与seq id no:20的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述gale基因包含seq id no:20的核苷酸序列。
47、在一个实施方案中，所述lgta基因和所述gale基因采用t7启动子；所述galt基因采用t7启动子、tac启动子、lac uv5启动子或t23启动子，所述t23启动子包含与seq id no:22的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述t23启动子包含seq id no:22的核苷酸序列。
48、在一个实施方案中，将所述gale基因、所述lgta基因和所述galt基因按照第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因的排列顺序构建于质粒载体中或者共同整合于所述大肠杆菌基因组中一个或多个插入序列is1。
49、在一个实施方案中，所述第一启动子为t7启动子；所述第二启动子为t7启动子、tac启动子、lac uv5启动子或t23启动子，所述t23启动子包含与seq id no:22的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述t23启动子包含seq id no:22的核苷酸序列。
50、在一个实施方案中，当第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因构建于所述质粒载体中时，所述第一启动子为所述质粒载体自有的启动子。
51、在一个实施方案中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述大肠杆菌基因组中的拷贝数为20-30。在一个实施方案中，所述质粒载体选自于prsfduet1、pre57-ter或pet28a。
52、在一个实施方案中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述大肠杆菌基因组中的拷贝数为20、21、22、23、24、25、26、27或28。
53、在一个实施方案中，所述方法还包括将编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的外源galf基因导入所述大肠杆菌中。
54、在一个实施方案中，所述方法还包括使所述大肠杆菌基因组中缺失wcaj基因、 lacz基因、 nagb基因、 araa基因、 pfka基因、 asla基因、 wecb基因、 gltb基因和 ugd基因中的一个或多个。
55、在一个实施方案中，所述方法还包括在所述大肠杆菌基因组中过表达 lacy基因、 fbp基因、 glms基因和 glna基因中的一个或多个。
56、在一个实施方案中，所述重组大肠杆菌为大肠杆菌bl21 (de3)菌株。
57、在一个实施方案中，所述galf基因编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶，所述葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶包含seq id no:5的氨基酸序列。
58、在一个实施方案中，所述 lacy基因编码β-半乳糖苷透性酶，所述β-半乳糖苷透性酶包含与seq id no:14的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述β-半乳糖苷透性酶包含seq id no:14的氨基酸序列。
59、在一个实施方案中，所述 fbp基因编码果糖-1,6-二磷酸酶1，所述果糖-1,6-二磷酸酶1包含与seq id no:15的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述果糖-1,6-二磷酸酶1包含seq id no:15的氨基酸序列。
60、在一个实施方案中，所述 glms基因编码谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶包含与seq id no:16的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶包含seq id no:16的氨基酸序列。
61、在一个实施方案中，所述 glna基因编码谷氨酰胺合成酶，所述谷氨酰胺合成酶包含与seq id no:17的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酰胺合成酶包含seq idno:17的氨基酸序列。
62、在一个实施方案中，所述方法还包括将所述galf基因插入所述大肠杆菌基因组中缺失所述 wcaj基因的位置。
63、在一个实施方案中，所述方法还包括将所述 lacy基因插入所述大肠杆菌基因组中缺失所述 pfka基因的位置。
64、在一个实施方案中，所述方法还包括将所述 fbp基因插入所述大肠杆菌基因组中缺失所述 asla基因的位置。
65、在一个实施方案中，所述方法还包括将所述 glms基因和所述 glna基因按照第三启动子- glms基因-第三启动子- glna基因的排列顺序整体插入所述大肠杆菌基因组中缺失所述 gltb基因的位置，所述第三启动子为tet启动子。
66、在一方面，提供了本文所述的重组大肠杆菌在生产乳糖-n-新四糖中的应用。
67、在一方面，提供了发酵生产乳糖-n-新四糖的方法，该方法包括如下步骤：
68、培养本文所述的重组大肠杆菌，获取含有乳糖-n-新四糖的发酵液。
69、在一个实施方案中，方法包括以下一个或多个步骤：
70、(1)所述培养包括：在种子培养基中培养所述重组大肠杆菌以得到种子，将所述种子接种于发酵培养基中诱导培养；
71、(2)在所述培养过程中补充碳源和乳糖，所述碳源包括葡萄糖和/或甘油。
72、本发明的整合型工程菌以eblt008菌株作为出发菌株构建而成。eblt008菌株由申请人自行制备。eblt008菌株是在大肠杆菌bl21菌株的基础上改造而获得，基因型为：bl21(de3) δlacz、δnagb、δaraa、δpfka::lacy、δasla::fbp、δwecb、δgltb::tet-glms-tet-glna、δugd。
73、本发明的整合型工程菌相对于出发菌株eblt008菌株而言进行了如下任意一种或一种以上的改造：
74、1. 上调lnnt合成途径的关键酶
75、β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶（β-1,3-n-acetylglucosaminyltransferase，lgta）和β-1，4-半乳糖基转移酶（β-1,4-galactosyltransferase，galt）是乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)合成途径中两个关键酶。
76、β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶可以催化5′-二磷酸尿嘧啶核苷-n-乙酰基葡萄糖胺（udp-n-acetylglucosamine，udp-glcnac）与乳糖生成乳糖-n-三糖ii（lacto-n-triose ii，lnt ii）（作为lnnt的前体之一）。β-1,4-半乳糖基转移酶可以催化lnt ii和udp-半乳糖（udp-galactose，udp-gal）生成lnnt。
77、本发明从不同来源的galt酶中筛选到了对lnt ⅱ和udp-gal具有较高催化能力的galt酶，并且从不同来源的lgta酶中筛选出对udp-glcnac和乳糖具有较高催化能力的lgta酶，并将这些酶的基因导入eblt008菌株中，以提高lnnt的生成量。
78、本发明在将筛选出来的外源galt基因导入eblt008菌株时，还从不同的启动子中筛选出能够较大幅度增强galt酶表达量的t23启动子，进一步提高lnnt的合成量。
79、2.增加udp-gal的供应
80、（1）引入外源的尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶（udp-glucose 4-epimerase，gale）基因
81、udp-glc能在来源于escherichia coli mg1655菌株的尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶（udp-glucose 4-epimerase，gale）的催化作用下合成udp-gal，但是由于eblt008菌株本身不存在 gale基因，故引入外源的 gale基因有利于增加udp-gal的供应，从而提高lnnt的合成量。本发明中，gale的genbank登录号为np_415280.3。
82、（2）引入 galf基因
83、 galf基因编码glucose-1-phosphate uridylyltransferase（galf），galf可以催化glc-1-p生成udp-glc，udp-glc再被gale催化生成udp-gal，故引入 galf基因有助于增加udp-gal的供应。
84、（3）敲除 wcaj基因
85、 wcaj基因编码udp-glucose lipid carrier transferase。敲除 wcaj基因，可以阻断udp-glc合成可拉酸（colanic acid；又称荚膜异多糖酸），故敲除 wcaj基因有利于抑制udp-glc的降解，增强udp-gal的供应，从而增加lnnt合成。
86、由于采用上述技术方案，本发明取得了如下技术效果：
87、第一方面，本发明优化了lnnt的合成路线，使得生产lnnt的整合型菌株在摇瓶发酵44h时的产量达到了2.98g/l以上，并且在摇瓶发酵终点时的最高产量达到了4.94g/l，因此，本发明的整合型菌株具有很高的lnnt产量，有利于lnnt的工业化生产。
88、第二方面，本发明的整合型菌株中，与lnnt合成相关的三个关键基因（ lgta基因、 galt基因和 gale基因）存在于基因组中，而并非以质粒形式存在于质粒中，因此，本发明的整合型菌株基本不存在质粒易丢失的问题，具有很好的遗传稳定性，多次传代后仍然具有很高的lnnt产量。
89、第三方面，本发明的整合型菌株中 lgta基因、 galt基因和 gale基因以多拷贝的形式插入is1位点中，这提高了上述三种基因的表达量并且基本不干扰lnnt的合成，有利于lnnt产量的进一步提高。
90、第四方面，本发明的整合型菌株中在发酵生产lnnt的过程中无需加入抗生素，减少了抗生素的滥用，并且在发酵产物中基本不存在抗生素残余，有利于后继对发酵产物的分离纯化。
1.一种重组大肠杆菌，其含有编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的外源lgta基因；
2. 根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中，所述lgta基因的核苷酸序列如seq idno:19所示。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌含有编码β-1,4-半乳糖基转移酶的galt基因和编码尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶的gale基因中的一种以上；
4. 根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其中，所述galt基因的核苷酸序列如seq idno:18所示；所述gale基因的核苷酸序列如seq id no:20所示。
5. 根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其中，所述lgta基因和所述gale基因采用t7启动子；所述galt基因采用t7启动子、tac启动子、lac uv5启动子或t23启动子，所述t23启动子的核苷酸序列如seq id no:22所示。
6.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其中，所述gale基因、所述lgta基因和所述galt基因按照第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因的排列顺序构建于质粒载体中或者共同整合于所述重组大肠杆菌基因组一个或多个插入序列is1中；
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述重组大肠杆菌基因组中的拷贝数为20-30；或者，所述质粒载体选自于prsfduet1、pre57-ter或pet28a。
8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述重组大肠杆菌基因组中的拷贝数为20、21、22、23、24、25、26、27或28。
9. 根据权利要求1至8任意一项所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌bl21 (de3)菌株；
10. 根据权利要求9所述的重组大肠杆菌，其中，所述galf基因编码氨基酸序列如seqid no:5所示的葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶；
11.根据权利要求10所述的重组大肠杆菌，其中，所述galf基因插入所述重组大肠杆菌基因组中缺失所述wcaj基因的位置；
12. 一种重组大肠杆菌，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmccno.：29790。
13. 一种重组大肠杆菌，其在大肠杆菌bl21 (de3)菌株的基础上进行了如下的基因改造：δlacz、δnagb、δaraa、δpfka::lacy、δasla::fbp、δwecb、δgltb::tet-glms-tet-glna、δugd、△wcaj::galf，并且t7启动子-gale基因-rbs-lgta基因-t23启动子-galt基因作为一个基因组合整体插入所述重组大肠杆菌基因组中is1位点并且其拷贝数为26；
14. 一种构建重组大肠杆菌的方法，其包括：将编码β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的外源lgta基因导入大肠杆菌中，所述lgta基因编码氨基酸序列如seq id no:2、seq idno:6、seq id no:7或seq id no:8所示的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述lgta基因的核苷酸序列如seq id no:19所示。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，在所述大肠杆菌中导入编码β-1,4-半乳糖基转移酶的galt基因和编码尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶的gale基因中的一种以上；
17. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述galt基因的核苷酸序列如seq id no:18所示；
18. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述lgta基因和所述gale基因采用t7启动子；所述galt基因采用t7启动子、tac启动子、lac uv5启动子或t23启动子，所述t23启动子的核苷酸序列如seq id no:22所示。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述gale基因、所述lgta基因和所述galt基因按照第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因的排列顺序构建于质粒载体中或者共同整合于所述大肠杆菌基因组中一个或多个插入序列is1；
20.根据权利要求19所述的方法，其中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述大肠杆菌基因组中的拷贝数为20-30；或者，所述质粒载体选自于prsfduet1、pre57-ter或pet28a。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，第一启动子-gale基因-rbs-lgta基因-第二启动子-galt基因在所述大肠杆菌基因组中的拷贝数为22、23、24、25、26、27或28。
22.根据权利要求14至21任意一项所述的方法，其中，还将编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的外源galf基因导入所述大肠杆菌中；
23. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述galf基因编码氨基酸序列如seq id no:5所示的葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶；
24.根据权利要求23所述的方法，其中，将所述galf基因插入所述大肠杆菌基因组中缺失所述wcaj基因的位置；
25.根据权利要求1-13中任一项所述的重组大肠杆菌在生产乳糖-n-新四糖中的应用。
26.发酵生产乳糖-n-新四糖的方法，该方法包括如下步骤：
27.根据权利要求26所述的方法，其包括以下步骤：
