本发明涉及病毒检测，具体地说，涉及牛恶性卡他热病毒raa反应体系、检测引物及其应用。
背景技术：
1、牛恶性卡他热(bovinemalignant catarrhal fever，bmcf)是由疱疹病毒科丙型疱疹病毒亚科的恶性卡他热病毒(malignant catarrhal fevervirus，mcfv)引起的，能引发恶性卡他热且具有致病性的病原主要是绵羊疱疹病毒2型和狷羚疱疹病毒1型两种病原。经常发生于水牛、奶牛和黄牛等多种反刍动物，是以高热、双侧角膜混浊、口鼻部坏死、口腔黏膜溃疡、高死亡率为特征的急性、高度致死性传染病。牛恶性卡他热病毒属于疱疹病毒科、恶性卡他热病毒属。核酸类型为dna，有囊膜。病毒主要存在于病牛的血液、脑、脾等组织中。
2、牛恶性卡他热病毒引起的临床症状容易与口蹄疫、水牛类恶性卡他热、牛瘟、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛传染性角膜结膜炎、牛蓝舌病、牛副流感混淆。
3、恶性卡他热给养牛业造成综合危害性强，高效合理的检测技术是疫病诊断的关键。现有技术中根据其流行特点、症状及病理变化来做出初步诊断，确诊则需进行实验室检查，包括病毒分离培养鉴定、动物试验和血清学诊断等。
4、血清学诊断有病毒—血清中和、补体结合、间接免疫荧光、琼脂扩散、间接酶联免疫吸附试验等，其确诊周期长、步骤繁复，不易现场确认。病毒的分离培养主要通过接种细胞，但是分离周期长、费用高，不适合基层的大规模检测。pcr检测技术需进行终点检测，需开盖进行凝胶电泳，极容易形成气溶胶污染，影响后续检测时间，且操作繁琐，检测总时长接近3个小时；并且存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分。
5、因此，需要对牛恶性卡他热病毒的检测进行进一步研究。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高的牛恶性卡他热病毒检测系统。
2、为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
3、牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系，其包括：序列分别如seq idno.7-9所示的牛恶性卡他热病毒raa上游引物、牛恶性卡他热病毒raa下游引物和cas12a-crrna。
4、本发明的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系还包括：ssdna和lbcas12a蛋白，所述ssdna的序列如seq id no.10所示并标记有荧光基团。
5、所述荧光基团包括本领域公知的荧光报告基团和荧光猝灭基团；优选，所述荧光报告基团可为fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas中的任一种；所述荧光猝灭基团可为tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcyl中的任一种。
6、优选，所述cas12a-crrna和lbcas12a蛋白的摩尔比为(0.5-3.0)：(0.1-0.6)，更优选为2.0：0.5。
7、本发明的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系包括：2.0～8.0mmol/ldntp、0.1～2.0μmol/l单链结合蛋白、0.5～5.0μmol/l重组酶蛋白、0.1～2.0u/μl dna聚合酶、10～60mmol/ltrishcl、20～80mmol/lnacl、5～15mmol/l二硫苏糖醇、0.5～10μmol/l牛恶性卡他热病毒raa上游引物、0.5～10μmol/l牛恶性卡他热病毒raa下游引物、0.5～3.0μmol/l cas12a-crrna、0.1～0.6μmol/l lbcas12a、0.1～1.0u/μl exo核酸外切酶、10～100nmol/l ssdna和0.4～1.2u/μl rnase inhibitor。
8、优选，包括6.2mmol/l dntp、1.0μmol/l单链结合蛋白、2.5μmol/l重组酶蛋白、1.2u/μl dna聚合酶，40mmol/l trishcl、35mmol/lnacl、10mmol/l二硫苏糖醇、5.0μmol/l牛恶性卡他热病毒raa上游引物、5.0μmol/l牛恶性卡他热病毒raa下游引物、2.0μmol/lcrrna、0.50μmol/l lbcas12a、0.4u/μl exo核酸外切酶、40nmol/l ssdna和0.6u/μl rnaseinhibitor。
9、本发明在进行检测应用时，总反应体系中还包括预混液buffera(20～55％聚乙二醇)，待测核酸模板，预混液buffer b(250～320mmol/l醋酸镁和80～140mmol/l氯化镁)。优选，先在本发明的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系中加入冻干保护剂，然后进行冻干保存，在检测时再与其他总反应体系组分混合，实现检测。
10、本发明使用raa-crispr-cas12a系统对牛恶性卡他热病毒进行荧光检测设备和无电源现场视觉检测的方法。通过将样品处理方法和raa技术与基于cas12a的检测相结合，可以在20分钟内使用荧光检测或通过肉眼判定结果。检测设备少、成本低、目视检测、全程封管操作，不会产生气溶胶污染，其应用可能有助于控制牛恶性卡他热的大流行。
11、本发明还提供raa检测引物对，其包括牛恶性卡他热病毒raa上游引物和牛恶性卡他热病毒raa下游引物，牛恶性卡他热病毒raa上游引物具有如seq id no.7所示的序列，牛恶性卡他热病毒raa下游引物具有如seq id no.8所示的序列。
12、本发明还提供cas12a-crrna分子，其具有如seq id no.9所示的序列。
13、本发明还提供一种检测牛恶性卡他热病毒的方法，所述方法为非疾病诊断或治疗目的，其将待测样本的核酸以上述牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系进行扩增，若出现扩增曲线或者扩增产物在紫外灯下表现为白光，则判断所述待测样本中含有牛恶性卡他热病毒。
14、本发明方法判读方法多样灵活，适于推广应用。优选，本发明的扩增反应程序为：38℃，60s-100s预热1循环；38-40℃，30s扩增，40循环。
15、本发明还提供上述牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系或raa检测引物对或cas12a-crrna分子在非疾病诊断或治疗目的的检测牛恶性卡他热病毒或制备牛恶性卡他热病毒raa检测冻干粉、冻干液、冻干管或试剂盒中的应用。
16、本发明的方法可应用于对产品中牛恶性卡他热病毒的检测以及抗牛恶性卡他热病毒疫苗和药物的研制。
17、本发明还提供一种牛恶性卡他热病毒检测冻干液，其包括：上述牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系、终浓度为10～15mmol/l的海藻糖、20～24mmol/l的甘露醇和5～21％的牛血清白蛋白。
18、本发明冻干液的体积优选为50μl(以无核酸酶水补足体积)。
19、优选，将50μl冻干液冻干后，加入43.5μl预混液buffera，5μl模板，1.5μl预混液bufferb，构成总反应体系50μl，进行待测样本检测。
20、本发明还提供一种牛恶性卡他热病毒检测冻干粉，其包括上述牛恶性卡他热病毒检测冻干液进行冷冻干燥后的组分；所述冷冻干燥的步骤包括：先于-80℃冷冻0.5～2h再进行设备冻干；所述设备冻干包括：预冻阶段、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥阶段；所述解析干燥阶段的条件为：将隔板温度升至-20～-25℃保持12～14h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～6h。
21、本发明还提供一种牛恶性卡他热病毒检测试剂盒，其包括上述牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系或raa检测引物对或cas12a-crrna分子或牛恶性卡他热病毒检测冻干液或牛恶性卡他热病毒检测冻干粉。
22、本发明的有益效果至少在于：
23、本发明提供了采用raa-crispr-cas12a系统进行牛恶性卡他热病毒检测的方法，其在常温(最适温度在37～42℃)下即可进行，不需要昂贵的温度循环设备，降低了成本，且不需要变性，整个反应过程在10～20min内即可完成；灵敏性高，从单个模板分子可得到大约1012数量级的扩增产物；特异性高，对非目标序列不产生反应。
24、本发明所用检测系统试剂可常温保存。除缓冲液及mg2+外，其余体系组分均可以干粉状态保存于反应管中，稳定且易于保存和运输，操作简便，在封闭的反应体系中减少了污染的可能性；且读取结果多样化，可通过real-time pcr对扩增过程进行实时监控，还可以在紫外灯下进行可视化显示。
1.牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系，其特征在于，包括：序列分别如seqid no.7-9所示的牛恶性卡他热病毒raa上游引物、牛恶性卡他热病毒raa下游引物和cas12a-crrna。
2.根据权利要求1所述的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系，其特征在于，还包括：ssdna和lbcas12a蛋白，所述ssdna的序列如seq id no.10所示并标记有荧光基团；
3.根据权利要求1或2所述的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系，其特征在于，包括：2.0～8.0mmol/l dntp、0.1～2.0μmol/l单链结合蛋白、0.5～5.0μmol/l重组酶蛋白、0.1～2.0u/μl dna聚合酶、10～60mmol/l trishcl、20～80mmol/lnacl、5～15mmol/l二硫苏糖醇、0.5～10μmol/l牛恶性卡他热病毒raa上游引物、0.5～10μmol/l牛恶性卡他热病毒raa下游引物、0.5～3.0μmol/l cas12a-crrna、0.1～0.6μmol/llbcas12a、0.1～1.0u/μl exo核酸外切酶、10～100nmol/l ssdna和0.4～1.2u/μl rnase inhibitor。
4.raa检测引物对，其特征在于，包括牛恶性卡他热病毒raa上游引物和牛恶性卡他热病毒raa下游引物，牛恶性卡他热病毒raa上游引物具有如seq id no.7所示的序列，牛恶性卡他热病毒raa下游引物具有如seq id no.8所示的序列。
5.cas12a-crrna分子，其特征在于，具有如seq id no.9所示的序列。
6.一种检测牛恶性卡他热病毒的方法，所述方法为非疾病诊断或治疗目的，其特征在于，将待测样本的核酸以权利要求1-3任一项所述的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系进行扩增，若出现扩增曲线或者扩增产物在紫外灯下表现为白光，则判断所述待测样本中含有牛恶性卡他热病毒。
7.权利要求1-3任一项所述的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系或权利要求4所述的raa检测引物对或权利要求5所述的cas12a-crrna分子在非疾病诊断或治疗目的的检测牛恶性卡他热病毒或制备牛恶性卡他热病毒raa检测冻干粉、冻干液、冻干管或试剂盒中的应用。
8.一种牛恶性卡他热病毒检测冻干液，其特征在于，包括：权利要求1-3任一项所述的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系、终浓度为10～15mmol/l的海藻糖、20～24mmol/l的甘露醇和5～21％的牛血清白蛋白。
9.一种牛恶性卡他热病毒检测冻干粉，其特征在于，包括权利要求8所述的牛恶性卡他热病毒检测冻干液进行冷冻干燥后的组分；所述冷冻干燥的步骤包括：先于-80℃冷冻0.5～2h再进行设备冻干；所述设备冻干包括：预冻阶段、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥阶段；所述解析干燥阶段的条件为：将隔板温度升至-20～-25℃保持12～14h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～6h。
10.一种牛恶性卡他热病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的牛恶性卡他热病毒raa-crispr cas12a反应体系或权利要求4所述的raa检测引物对或权利要求5所述的cas12a-crrna分子或权利要求8所述的牛恶性卡他热病毒检测冻干液或权利要求9所述的牛恶性卡他热病毒检测冻干粉。
