本发明属于新药合成/药物制剂领域，公开了一种二乙基二硫代氨基甲酸酯(dtc)和胆固醇基偶联物的制备方法和基于该化合物制备的微粒制剂及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术：
1、双硫仑(disulfiram，dsf)作为戒酒药等已在临床使用了70多年，具有完善的药代动力学，安全性、耐受性和低成本等优势。dsf作为老药新用的典型药物，在肿瘤治疗与预防方面展现出巨大的潜力。口服摄入后，超过99％的dsf在胃的酸性环境中迅速转化为二乙基二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamate，dtc)。dsf和dtc都通过胃肠道粘膜迅速吸收到门脉循环中，并在肝脏中富集并迅速代谢和降解。dtc是强效金属螯合物，可通过巯基基团与多种重金属离子螯合。dtc与铜离子螯合成具有抗癌活性的cu(dtc)2，所以dtc是双硫仑发挥抗肿瘤作用的主要活性成分。与正常组织细胞相比，很多肿瘤细胞都具有较高的铜离子浓度，双硫仑给药后可在肿瘤组织中形成较高浓度的cu(dtc)2，从而特异性杀伤肿瘤细胞。但是，目前为止进行的与双硫仑相关的临床实验，均无取得显著治疗效果的报道。可能是双硫仑及cu(dtc)2等化合物存在成药性较差，给药后降解和消除较快，对于肿瘤组织与肿瘤细胞的靶向性或者释药性不足等缺点。因此，需要围绕dsf或dtc开发更有效的化合物及其剂型，提高有效性、成药性、靶向性和稳定性等，以充分发挥治疗作用。
技术实现思路
1、针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明目的之一是合成有效性和/或成药性更高和/或毒性更低的双硫仑活性代谢产物dtc的前药化合物——胆固醇基-dtc偶联物，并提供可行的制备方法。
2、本发明的目的之二在于提供化合物的应用及其剂型，包括作为载体用于纳米制剂的制备方法，以及作为药物成分与化疗药联合使用治疗肿瘤的应用。
3、本发明的目的之三在于探讨化合物抗肿瘤的可能机制，并指出于常见化疗药物如dox协同抗肿瘤的可行性。
4、本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
5、在分子结构中引入胆固醇基，将dtc通过体内可以降解的化学键，与胆固醇基相连。这样，新化合物将具有胆固醇的一些优势，例如与细胞亲和性增加，纳米制剂成药性增强等性质，从而达到我们的设计目的。
6、从合成以及体内降解的角度考虑，该化合物可具有下式的基本结构。
7、
8、其中x为合成过程中化学惰性的基团，包括但不局限于烷基或芳基。a为刺激响应敏感键，所述的刺激响应敏感键，包括但不局限于可响应于肿瘤微环境或肿瘤细胞中的ph、谷胱甘肽、活性氧或高表达的酶；所述gsh响应键包括但不限于-s-、-s-s-结构；所述ros响应敏感键包括但不局限于苯硼酸键、缩硫酮键或草酸酯键；所述肿瘤组织高表达的酶包括但不限于基质金属蛋白酶、弗林蛋白酶、豆荚蛋白酶、fap-α酶或组织蛋白酶等。
9、再进一步，化合物包括但不局限于具有以下结构的化合物(c-dtc)：
10、
11、上述c-dtc的制备方法，包括以下基本反应过程：
12、
13、基本制备过程为(1)在二氯甲烷中，将二乙胺、巯基乙醇、二硫化碳、三乙胺、四溴化碳混合反应，得到dtc-oh。
14、(2)在二氯甲烷中，将dtc-oh、胆固醇酯甲酰氯、吡啶混合后进行酯化反应，得到具有式ⅰ结构的c-dtc。
15、所述步骤(1)中，二乙胺、巯基乙醇、二硫化碳、三乙胺、四溴化碳的摩尔比为1:1:1:(1-2):(1-2)；所述反应的温度为10-35℃；反应的时间为1-4h，优选为2-4h。
16、所述步骤(2)中，dtc-oh、胆固醇酯甲酰氯、吡啶的摩尔比为1:(1-2):(1-2)；反应的温度为10-35℃；反应的时间为1-8h，优选为4-8h。
17、本发明的目的之二在于以c-dtc为例，提供胆固醇基-dtc偶联物作为药物以及载体用于纳米制剂的制备方法。c-dtc可与磷脂材料共用包载药物制备脂质体给药系统，或c-dtc与其他载体辅料共用包载药物制备其它类型的微粒给药系统。根据药物的性质，各个剂型均可以采用符合制剂目的的方法进行制备。如脂质体，可以用薄膜分散法、冷冻干燥法、逆相蒸发法、超声法等。
18、例如，采用薄膜分散法将c-dtc与磷脂材料共用包载药物制备脂质体给药系统，也是符合基本的制备流程，基本过程如下：
19、当待包载药物为脂溶性药物时，其制备过程为将c-dtc、磷脂、脂溶性药物等置于茄形瓶中，加入有机溶剂溶解，将有机混合液减压下旋转蒸发，形成连续均匀的薄膜；加入水溶液并分散均匀，得到c-dtc与磷脂材料共用包载脂溶性药物制备脂质体给药系统。
20、当待包载药物为盐酸阿霉素等化合物时，可利用主动载药法。如采用硫酸铵梯度法制备盐酸阿霉素(dox)脂质体：其基本制备过程为将c-dtc、磷脂等置于茄形瓶中，加入有机溶剂溶解，将有机混合液在减压下旋转蒸发，形成连续均匀的薄膜；在得到的薄膜中加入硫酸铵水溶液并分散均匀，形成硫酸铵脂质体，然后采用透析等方式将未包封的硫酸铵去除，在透析后的脂质体中加入dox水溶液，包封一段时间后，得到包载dox的c-dtc脂质体给药系统。
21、再例如，可采用乳化溶剂挥发法将c-dtc自组装包载药物制备成微粒，其基本制备过程如下：将c-dtc溶于有机溶剂中形成有机相，水溶性辅料溶解于水中，形成水相。将水相与油箱混合得到悬浊液；然后将悬浊液采用剪切、超声等方法分散，减压旋蒸等方式除去有机溶剂，即得到c-dtc自组装纳米粒制剂。
22、与其它载体辅料合用时，可以根据载体与药物的性质，灵活采用相应的制备方法。例如，当待包载药物为脂溶性药物，合用载体辅料为固体脂质时，可以将脂质加热熔融以后，再加入药物和c-dtc混匀；当合用辅料为液体脂质，如制备乳剂时，可以将药物和c-dtc溶解于液体脂质中；当合同的辅料为plga时，可以将药物、c-dtc、plag共同溶解于有机溶液中。然后再将其与水相混合，分散均匀，去除有机溶剂，
23、其中所述的磷脂材料包括各种类型的天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂中的一种或多种的混合物。
24、所述的其他载体辅料为常用的微粒制剂载体辅料，如plga、mpeg－plga、脂肪酸单甘油酯、脂肪酸二甘油酯、脂肪酸三甘油酯、脂肪酸等，还包括起到长循环作用的peg与/或各种靶向作用基团修饰的辅料的一种或者混合物，以及可电离脂质、阳离子脂质等辅料。除了上述常用的载体材料外，无机载体或者金属载体，也可以采用相应的制备方法制备。
25、所述的水溶性辅料包括pva、peg、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、吐温80、vc或sds等符合给药途径要求的辅料或增加稳定性、调节渗透压等要求的辅料。制剂可以采取冻干保护以延长稳定性。
26、所制备的纳米制剂还可以加入peg等修饰的长循环修饰材料，透明质酸等可药用靶向材料，可电离脂质、以实现降低毒副作用，增强疗效的目的。
27、微粒制剂，也称微粒给药系统(microparticle drug delivery system，mdds)，系指药物或与适宜载体(一般为生物可降解材料)，经过一定的分散包埋技术制得具有一定粒径(微米级或纳米级)的微粒组成的固态、液态、半固态或气态药物制剂，具有掩盖药物的不良气味与口味、液态药物固态化、减少复方药物的配伍变化，提高难溶性药物的溶解度，或提高药物的生物利用度，或改善药物的稳定性，或降低药物不良反应，或延缓药物释放、提高药物靶向性等作用。
28、本发明优选的微粒给药系统主要包括纳米粒、微粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束中的一种或者几种的混合物。
29、本发明的目的之三在于探讨c-dtc抗肿瘤的可能机制，并指出于常见化疗药物如dox协同抗肿瘤的可行性。由于c-dtc本身优良的纳米制剂辅料功能，因此将其作为活性成分用于与化疗药等联合治疗肿瘤，适用的剂型非常广泛。而且，从抗肿瘤机制上，也可以与不同类型的抗肿瘤药物协作，发挥更有效的抗肿瘤作用，用于治疗乳腺癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等类型的肿瘤。
30、从理论上讲，本专利发明的化合物，除了可以发挥肿瘤治疗作用，也可以发挥与dtc相关的其它药理作用。例如，双硫仑被证实具有抗辐射、抗纤维化、抗炎、保护主动脉等作用，双硫仑在体内不可避免的会首先降解为dtc，因此本专利发明的化合物，可能也具有类似的疗效。
31、除了偶联物本身，其药学上可接受的金属配合物、螯合物、氘代物或前药，也应该具有抗肿瘤作用。尤其是其与铜离子的螯合物，具有更强的抗肿瘤作用。
32、总之，为了克服双硫仑和dtc的局限性，本发明提供了一种新型的dtc前药，以c-dtc为例，具有以下优点：
33、优点1：与双硫仑相比，c-dtc抗肿瘤活性得到显著提高。
34、优点2：c-dtc可以从多方面提高抗肿瘤药物的抗肿瘤作用，包括但不局限于抑制肿瘤细胞克隆形成、抑制肿瘤细胞迁移能力、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤干细胞等。
35、优点3：c-dtc的加入，能够显著提高肿瘤细胞对纳米制剂的摄取率。
36、优点4：静脉给药后，能够显著提高含c-dtc纳米制剂在肿瘤组织中的聚集与滞留。
37、优点5:c-dtc成药性优于双硫仑及dtc相关制剂。c-dtc具有药辅两用特性，既能够自组装成纳米粒，也可载药，还可以与其它辅料一起，制成脂质体等纳米制剂。
38、优点6：c-dtc能够全部或者部分替代胆固醇的作用，c-dtc可与磷脂形成囊泡结构，用于脂质体的制备。因此，c-dtc还具有胆固醇的一些优点。
1.一种二乙基二硫代氨基甲酸-胆固醇偶联物及其药学上可接受的金属配合物、螯合物、氘代物或前药。其特征在于所述化合物的结构中同时包含胆固醇基以及二乙基二硫代氨基甲酸酯基(dtc)。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，可具有式ⅰ的基本结构：
3.如权利要求2所述的化合物，包括但不局限于以下结构的化合物：
4.如权利要求1-3所述的化合物的应用，其特征在于，具有肿瘤治疗作用。
5.如权利要求4所述的化合物的应用，其特征在于，该类化合物与肿瘤治疗药物联合使用具有协同增效的作用，包括但不局限于盐酸阿霉素。
6.如权利要求1-5所述的化合物的应用，其特征在于，该化合物可用于纳米粒、脂质体等微粒型给药系统的制备，优选粒径范围为10-500nm。
7.如权利要求6所述的化合物的应用，其特征在于，所述的化合物可用于制备微粒型给药系统，包括但不局限于：该化合物自组装的纳米粒；或者该化合物单独作为载体包载其它药物形成纳米粒；或者该化合物与其它载体材料共用制成脂质体、乳剂、纳米粒、脂质纳米载体(lnp)、胶束等微粒给药体系；或者该化合物与各种磷脂材料共用包载药物制备脂质体给药系统；或者该化合物与其他载体辅料共用包载药物制备乳剂、纳米粒、lnp、胶束等微粒给药系统。
8.如权利要求6和7所述的化合物的应用，其特征在于，含有该化合物的纳米制剂具有促进肿瘤细胞摄取以及提高给药后肿瘤靶向性的作用。
9.如权利要求1-3所述的化合物的应用，其特征在于，其具有与二乙基二硫代氨基甲酸酯(dtc)基团有关的治疗能力的潜力。
10.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，可以采用以下方法制备：
