本发明涉及生物，特别是涉及一种群体感应猝灭酶及其筛选方法和应用。
背景技术：
1、随着国家经济社会的快速发展，人口日益密集，人员流动性大，不可避免地会导致传染病的发生。特别是耐药细菌感染的预防和治疗已成为临床亟待解决的关键科技问题。除抗生素修饰酶(氨基糖苷修饰酶、β-内酰胺酶等)的表达、抗生素外排泵、膜通透性改变等因素外，细菌生物被膜的形成是导致细菌耐药的最重要机制之一。
2、生物膜(biofilm,biofilm)，是由细菌及其胞外分泌物(水合作用)基质组成的结构性细菌群落，它的结构是由许多因素共同作用决定的，包括营养成分梯度和代谢废物梯度、胞外聚合物和表面活性剂、细胞表面性质、细胞程序化死亡和分化、环境诱导、细胞信号转导等。大多数细菌能在特定条件下形成生物膜，以抵抗外界应激和宿主免疫攻击。细菌生物被膜形成后，生活在生物被膜中的细菌的生物学特性与浮游状态下的细菌明显不同，主要表现为环境变化对细菌的影响大大降低，尤其是细菌对抗生素的敏感性大大降低。据nih统计，80％以上的细菌性疾病与生物膜有关，这也是临床实践中耐药菌反复感染的重要原因。
3、生物膜发育是一种受群体感应(qs)调节的细菌群体行为。qs是指细菌在繁殖过程中释放出特定的信号分子到周围环境中，当信号分子积累到一定阈值时可以反向进入细菌细胞并与转录因子结合，从而相应地激活下游基因的表达，使细菌无法通过单细胞的生理功能和调控机制，如形成生物膜基因表达等)。在大多数细菌生物膜形成之初，通过聚集感测信号分子的积累和触发，可以合成形成生物膜所需的糖蛋白等大分子，这些大分子是细菌生物膜形成的物质基础。
4、群体感应，尤其是其信号分子，是启动细菌生物膜形成的关键步骤。因此，抑制qs是抑制生物膜发生发展甚至解决细菌耐药问题的一种新的策略和有效途径，具有重要的科学意义和临床价值。其中最有效的措施之一是使用群体感应猝灭酶(qqase)，它专门降解群体感应qs的信号分子，从而抑制生物膜形成所需糖蛋白的合成，阻断群体感应或生物膜的发展。
5、需要注意的是，由于生物膜的异质性，生物膜中的各种细菌往往采用不同的信号分子。因此，qs分子猝灭酶的发掘与测试可以增强群体淬灭酶的实用性，从而有效针对不同的菌群破坏其生物膜，有助于解决细菌耐药问题，具有良好的临床应用前景。
6、不同微生物产生的群体感应信号分子具有高度的保守性。它们都具有相同的高丝氨酸内酯环结构，但碳链长度不同，或邻苯二甲酸侧链上取代基不同。在研究的群体感应淬灭酶中，脱羧酶和内酯酶可以把内酯环水解成酰基高丝氨酸，而脱氨酶和酰基转移酶可以将酰基侧链与高丝氨酸内酯环分离，从而生成高丝氨酸内酯和脂肪酸。但是总体而言，灵敏度相对不高。
技术实现思路
1、基于此，有必要提供一种群体感应猝灭酶的筛选方法，通过该筛选方法能够获得灵敏度较高的群体感应猝灭酶。
2、此外，还有必要提供一种群体感应猝灭酶及其应用。
3、一种群体感应猝灭酶的筛选方法，包括如下步骤：
4、构建携带待筛酶基因的待筛转染质粒；
5、向两组第一哺乳动物细胞中分别加入所述待筛转染质粒和对照转染质粒进行转染，然后加入群体感应信号分子继续培养，培养结束后收集上清，得到待筛组上清及对照组上清；
6、向两组第二哺乳动作细胞中均加入receiver进行转染，然后分别加入所述待筛组上清及所述对照组上清继续培养，培养结束后收集细胞，得到待筛组细胞及对照组细胞；
7、对所述待筛组细胞及所述对照组细胞进行荧光值检测和比较，若所述待筛组细胞的荧光值小于所述对照组细胞的荧光值，则所述待筛酶为群体感应猝灭酶。
8、上述群体感应猝灭酶的筛选方法中，通过构建携带待筛酶基因的待筛转染质粒，并转染哺乳动物细胞，然后加入群体感应信号分子，若待筛酶为群体感应猝灭酶，则群体感应信号分子随着细胞中群体感应猝灭酶表达的增多，其被降解的越多，上清中存在的群体感应猝灭越少，收获上清后加入到转染receiver(受qs小分子诱导)的细胞中，通过观察诱导的荧光值能够判断群体感应猝灭酶对群体感应信号分子的降解能力的强弱，从而获得灵敏度较高的群体感应猝灭酶。经试验验证，通过上述群体感应猝灭酶的筛选方法筛选到四种灵敏度较高的群体感应猝灭酶，分别为btaiia、araiib、afaiib、hspon1，与未添加群体感应猝灭酶相比，btaiia的ec50增大1000倍，hspon1的ec50增大100倍，araiib、afaiib的ec50菌增大10倍左右，其分子信号灵敏度较高。其中，ec50，半最大效应浓度(concentrationfor 50％of maximal effect,ec50)是指能引起50％最大效应的浓度。
9、在其中一个实施例中，构建所述待筛转染质粒的步骤包括：对所述待筛酶的群体感应降解能力进行初筛，然后对具有群体感应降解能力的所述待筛酶构建所述待筛转染质粒；
10、其中，对所述待筛酶的群体感应降解能力进行初筛的步骤包括：
11、构建能够表达所述待筛酶的表达载体，得到初筛表达载体；
12、将所述初筛表达载体及对比表达载体分别导入原核宿主菌中，得到初筛重组菌和对比菌，其中，所述对比表达载体中未携带所述待筛酶基因；
13、采用含有所述群体感应信号分子的培养基分别培养所述初筛重组菌和所述对比菌，培养结束后收集上清，得到初筛上清和对比上清，
14、对所述初筛上清和所述对比上清进行荧光值检测和比较，若所述初筛上清的荧光值小于所述对比上清的荧光值，则所述待筛酶具有群体感应降解能力。
15、在其中一个实施例中，含有所述群体感应信号分子的培养基中，所述群体感应信号分子的终浓度为10-9m。
16、在其中一个实施例中，所述原核宿主菌为大肠杆菌。
17、在其中一个实施例中，所述对所述待筛组细胞及所述对照组细胞进行荧光值检测和比较的步骤之后，包括检测筛出为群体感应猝灭酶的所述待测酶的灵敏度的步骤：
18、向所述第一哺乳动物细胞中加入所述待筛转染质粒进行转染，然后分别加入浓度梯度的所述群体感应信号分子继续培养，培养结束后收集上清，得到待测上清；
19、向所述第二哺乳动作细胞中加入receiver进行转染，然后加入所述待测上清及对应浓度梯度的所述群体感应信号分子继续培养，培养结束后收集细胞，得到待测细胞；
20、对所述待测细胞进行荧光值检测，并生成所述荧光值与对应的所述群体感应信号分子的浓度的诱导曲线，根据所述诱导曲线获得所述待测酶的灵敏度。
21、在其中一个实施例中，所述群体感应信号分子的浓度梯度如下：终浓度为0、10-10m、10-9m、5×10-9m、10-8m、10-7m、10-6m、10-5m、10-4m。
22、在其中一个实施例中，向所述第一哺乳动物细胞中加入所述待筛转染质粒进行转染的步骤中，每个2×105个所述第一哺乳动物细胞中加入1μg所述待筛转染质粒。
23、在其中一个实施例中，所述向两组第一哺乳动物细胞中分别加入所述待筛转染质粒和对照转染质粒进行转染，然后加入群体感应信号分子继续培养，培养结束后收集上清的步骤包括：向两组所述第一哺乳动物细胞中分别加入所述待筛转染质粒和所述对照转染质粒转染5h-6h，然后加入终浓度为10-9m的所述群体感应信号分子继续培养48h后收集上清，其中，每个2×105个所述第一哺乳动物细胞中加入1μg转染质粒。
24、在其中一个实施例中，所述向两组第二哺乳动作细胞中均加入receiver进行转染，然后分别加入所述待筛组上清及所述对照组上清继续培养，培养结束后收集细胞的步骤包括：向两组所述第二哺乳动作细胞中均加入receiver转染5h-6h，然后分别加入所述待筛组上清及所述对照组上清继续培养48h后收集细胞，其中，每个2×105个所述第二哺乳动物细胞中加入1μg receiver和500μl对应上清。
25、在其中一个实施例中，所述群体感应信号分子包括肉桂酸-高丝氨酸内酯。
26、在其中一个实施例中，所述第一哺乳动物细胞为293t细胞，所述第二哺乳动物细胞为293t细胞。
27、在其中一个实施例中，对所述待筛组细胞及所述对照组细胞进行荧光值检测的方法为流式细胞术。
28、上述筛选方法在制备群体感应猝灭酶中的应用。
29、一种群体感应猝灭酶，所述群体感应猝灭酶为采用上述筛选方法筛选得到。
30、在其中一个实施例中，所述群体感应猝灭酶的氨基酸序列如seq id no.1-seq idno.7所示。
31、上述群体感应猝灭酶在制备消除细菌生物膜的形成的药物及/或抑制细菌群体感应的药物中的应用。
1.一种群体感应猝灭酶的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，构建所述待筛转染质粒的步骤包括：对所述待筛酶的群体感应降解能力进行初筛，然后对具有群体感应降解能力的所述待筛酶构建所述待筛转染质粒；
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，含有所述群体感应信号分子的培养基中，所述群体感应信号分子的终浓度为10-9m；
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述对所述待筛组细胞及所述对照组细胞进行荧光值检测和比较的步骤之后，包括检测筛出为群体感应猝灭酶的所述待测酶的灵敏度的步骤：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述群体感应信号分子的浓度梯度如下：终浓度为0、10-10m、10-9m、5×10-9m、10-8m、10-7m、10-6m、10-5m、10-4m；
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述向两组第一哺乳动物细胞中分别加入所述待筛转染质粒和对照转染质粒进行转染，然后加入群体感应信号分子继续培养，培养结束后收集上清的步骤包括：向两组所述第一哺乳动物细胞中分别加入所述待筛转染质粒和所述对照转染质粒转染5h-6h，然后加入终浓度为10-9m的所述群体感应信号分子继续培养48h后收集上清，其中，每个2×105个所述第一哺乳动物细胞中加入1μg转染质粒；
7.根据权利要求1-6任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述群体感应信号分子包括肉桂酸-高丝氨酸内酯；
8.权利要求1-7任一项所述的筛选方法在制备群体感应猝灭酶中的应用。
9.一种群体感应猝灭酶，其特征在于，所述群体感应猝灭酶为采用权利要求1-7任一种筛选方法筛选得到。
10.根据权利要求9所述的群体感应猝灭酶，其特征在于，所述群体感应猝灭酶的氨基酸序列如seq id no.1-seq id no.7所示。
11.权利要求9-10任一项所述的群体感应猝灭酶在制备消除细菌生物膜的形成的药物及/或抑制细菌群体感应的药物中的应用。
