本发明涉及血液制品，具体而言，涉及一种血制品的制备方法。
背景技术：
1、凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分，在出血时被激活并和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口，该过程即凝血。整个过程分为凝血酶原的激活及凝胶状纤维蛋白的形成两个阶段，上述成分部分由肝脏合成，可以被香豆素所抑制。
2、为统一命名，世界卫生组织按被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子ⅱ、ⅴ、ⅶ、ⅷ、ⅸ、ⅹ、ⅺ、ⅷ等，其中凝血因子ⅷ可由肝细胞产生，也可由窦内皮细胞与库普弗细胞产生，或者如肾脏等其它组织也可产生。当肝细胞合成功能减退时，窦内皮细胞及库普弗细胞仍维持凝血因子ⅷ的合成；肝脏清除功能减退，内毒素及免疫因素刺激使它的合成与释放增加。血管性血友病因子(von willebrand factor,vwf)主要由肝外合成，肝硬化患者可能由于内毒素血症，血管内皮细胞功能异常，使其释放增加。vwf可同时与胶原纤维和血小板结合，当血管破裂时大量血小板以vwf为中介，粘附在胶原纤维上，形成血栓，得以止血。纤维粘连蛋白(fn)属非胶原糖蛋白的一种，称为冷不溶球蛋白，广泛存在于动物界，包括海绵、海胆及哺乳动物类。在脊椎动物中，fn以可溶的形式存在于血浆和各种体液中，称为血浆纤维粘连蛋白；以不溶的纤维存在于细胞外基质、细胞之间及某些细胞表面，称为细胞纤粘连蛋白。
3、现有技术通常着眼于一种或两种制品的分离提取和纯化，其他成分作为杂蛋白被去除，很难再得到利用。为此申请号202310031581.4的中国专利，作为在先申请公开了一种通过两步层析法获得三种血液制品的制备工艺，将预处理后的血浆原料进行第一次阴离子交换层析，洗涤液的主要成分为vwf和fn的混合液，洗脱液的成分为ⅷ，将洗涤液泵入第二次阴离子交换层析，洗涤液和洗脱液中分别收集fn和vwf，实现了同时对三种成分的分离制备；但由于fn、vwf的等电点接近且fn为粘性蛋白，上述层析方法的分离效果不理想，导致fn、vwf的纯度低且收率差。面对国内生物制品紧缺的现状，如何提高血液制品的收率、纯度，对血液制品行业具有积极意义。有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明解决的问题是现有技术中同时制备三种血液制品的工艺不合理导致vwf、fn的收率、纯度不理想，有待进一步提高。
2、为解决上述问题，本发明提供一种利用fⅷ生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，包括：
3、s1、取经阴离子交换层析fviii的洗涤液，按照体积比为1:50-80加入质量浓度为1-4％的氢氧化铝凝胶，室温条件下以200-400rpm/min的转速进行搅拌30-50min；
4、s2、固液分离后收集沉淀和第一上清液，分别用于制备纤维连接蛋白、血友病因子的制备。
5、优选的，步骤s2中将步骤s1中吸附后的溶液放入提前预冷的离心机中，以2000-4000rpm的速度离心10-30min进行固液分离。
6、优选的，步骤s2中纤维连接蛋白的制备方法为：向沉淀中按照体积比为3-4:1加入解离液，所述解离液为ph为4的0.6m氯化钠溶液，室温下以250-500rpm搅拌20-30min，以4000-5000rpm的速度离心5-10min收集第二上清液，将第二上清液用30kd分子量的超滤膜进行浓缩，然后恒体积透析得到fn的浓缩液，冻干。
7、优选的，步骤s2中血友病因子的制备方法为：用1～3倍体积的第二平衡液冲洗第二阴离子交换层析柱，装填介质为emd tmae(m)，将第一上清液以1-2bv/h流速上柱，之后用1～3倍体积的第二洗涤液洗涤，再用1～3倍体积的第二洗脱液洗脱，当洗脱流出液的absod280吸收值＞20mau时，收集洗脱液，用30kd超滤膜对所述第一上清液进行浓缩，然后恒体积透析得到vwf的浓缩液，冻干。浓缩倍数根据效价确定，恒体积透析后装至容器内进行冻干，确保最终产品的剂量浓度一致。
8、优选的，所述第二平衡液包括100～120mm氯化钠、10mm枸橼酸、120mm甘氨酸、1mm氯化钙，ph值7.0±0.5，所述第二洗涤液为190～220mm氯化钠、10mm枸橼酸、120mm甘氨酸、1mm氯化钙，ph值7.0±0.5，所述第二洗脱液包括370～400mm氯化钠、10mm枸橼酸、120mm甘氨酸、1mm氯化钙，ph值7.0±0.5。
9、优选的，所述凝血因子ⅷ的生产废液采用如下方法制备：
10、s01、将血浆原料经过预处理后泵入到平衡好的第一阴离子交换层析柱中；
11、s02、用1～3倍体积的第一平衡液冲洗第一阴离子交换层析柱，装填介质为toyopearl deae650m，并用1～3倍体积的第一洗涤液洗涤，当洗涤流出液的absod280吸收值＞20mau时，即凝血因子ⅷ的生产废液；然后用1～3倍体积的第一洗脱液洗脱，当洗脱流出液的absod280吸收值＞20mau时收集，得到主要成分为ⅷ的收集液。
12、优选的，步骤s01中所述血浆原料预处理包括：
13、s11、冷沉淀制备：将血浆原料融化后在0～4℃下离心制备冷沉淀；
14、s12、冷沉淀溶解：用3～5倍冷沉淀体积的氨丁三醇将冷沉淀在室温下溶解；
15、s13、peg沉淀：加入聚乙二醇使聚乙二醇的浓度达到3～5％，离心分别收集上清液和peg沉淀；
16、s14、s/d灭活：将所述上清液搅拌，并加入s/d溶液，使最终制品中s/d溶液终含量为10.0±3.0g/l聚山梨酯80和3.0士0.3g/l磷酸三丁酯，调节最终制品的ph为7.0±0.5，并保持在温度24.0～26.0℃条件下搅拌灭活至少6h。
17、优选的，所述第一平衡液包括80～120mm氯化钠、16～24mm氨丁三醇、100～140mm甘氨酸、35～45mm氯化钙，ph值为7.0±0.2，所述第一洗涤液包括140～180mm氯化钠、16～24mm氨丁三醇、100～140mm甘氨酸、35～45mm氯化钙、40～80mm聚山梨酯80，ph值7.0±0.2，所述第一洗脱液包括20～30mm组氨酸、140～180mm氯化钠、20mm氨丁三醇、100～140mm甘氨酸、180～220mm氯化钙，ph值7.0±0.2。
18、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：1)通过对废弃人凝血因子ⅷ层析洗涤液中添加氢氧化铝凝胶吸附实现凝血因子vwf与纤维连接蛋白fn的有效分离，制备的vwf、fn收率高且效价损失少；2)操作简单、耗时短，实现了对血浆原料的充分利用，提高经济效益。
1.一种利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，步骤s2中将步骤s1中吸附后的溶液放入提前预冷的离心机中，以2000-4000rpm的速度离心10-30min进行固液分离。
3.根据权利要求1所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，步骤s2中纤维连接蛋白的制备方法为：向沉淀中按照体积比为3-4：1加入解离液，所述解离液为0.6m氯化钠溶液，ph＝4.0，室温下以250-500rpm搅拌20-30min，以4000-5000rpm的速度离心5-10min收集第二上清液，将第二上清液用30kd分子量的超滤膜进行浓缩，然后恒体积透析得到fn的浓缩液，冻干。
4.根据权利要求1所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，步骤s2中血友病因子的制备方法为：用1～3倍体积的第二平衡液冲洗第二阴离子交换层析柱，装填介质为emd tmae(m)，将第一上清液以1-2bv/h流速上柱，之后用1～3倍体积的第二洗涤液洗涤，再用1～3倍体积的第二洗脱液洗脱，当洗脱流出液的absod280吸收值＞20mau时，收集洗脱液，用100kd超滤膜对所述第一上清液进行浓缩，然后恒体积透析得到vwf的浓缩液，冻干。
5.根据权利要求4所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，所述第二平衡液包括100～120mm氯化钠、10mm枸橼酸、120mm甘氨酸、1mm氯化钙，ph值7.0±0.5，所述第二洗涤液为190～220mm氯化钠、10mm枸橼酸、120mm甘氨酸、1mm氯化钙，ph值7.0±0.5，所述第二洗脱液包括370～400mm氯化钠、10mm枸橼酸、120mm甘氨酸、1mm氯化钙，ph值7.0±0.5。
6.根据权利要求1所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，所述凝血因子ⅷ的生产废液采用如下方法制备：
7.根据权利要求6所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，步骤s01中所述血浆原料预处理包括：
8.根据权利要求6所述的利用凝血因子ⅷ的生产废液同时制备血友病因子和纤维蛋白原的方法，其特征在于，所述第一平衡液包括80～120mm氯化钠、16～24mm氨丁三醇、100～140mm甘氨酸、35～45mm氯化钙，ph值为7.0±0.2，所述第一洗涤液包括140～180mm氯化钠、16～24mm氨丁三醇、100～140mm甘氨酸、35～45mm氯化钙、40～80mm聚山梨酯80，ph值7.0±0.2，所述第一洗脱液包括20～30mm组氨酸、140～180mm氯化钠、20mm氨丁三醇、100～140mm甘氨酸、180～220mm氯化钙，ph值7.0±0.2。
