本发明属于医学和生物学，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其单克隆抗体与应用。
背景技术：
1、单克隆抗体技术具有划时代的意义，对生物医学产生了巨大的的影响。单克隆抗体高纯度、高浓度和高特异性的特点，对抗体本身的性质及其产生的机理的研究提供了更大的帮助，被广泛应用于生物医学领域。非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)感染家猪和野猪引起的急性、烈性传染病，患病猪主要表现为全身出血、呼吸障碍和神经症状，急性死亡率可高达100％。自1921年在肯尼亚首次发现以来，在非洲撒哈拉以南地区持续流行，对养猪业造成了严重损失。2007年首次传入格鲁吉亚，并迅速蔓延到东欧的高加索地区，同年3月，asf疫情在俄罗斯远东地区的伊尔库茨克爆发。我国于2018年8月在辽宁省沈阳市首次确诊asf疫情，之后asf迅速传播至全国各地，给生猪养殖业带来巨大危害，对社会和经济造成严重影响。尽管asf至今已有百年历史，但仍缺乏有效的商业化疫苗和抗病毒药物，早期防控主要依赖于检测诊断，因此建立快速、高效的检测方法仍然至关重要。
2、asfv是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种单分子线状双链dna病毒，基因组全长为170kb-190kb，包括151-167个开放型阅读框，编码150-200种蛋白质，成熟的病毒粒子中含有50种以上的主要蛋白。病毒颗粒外观呈正二十面体对称结构，直径约为260-300nm，自内而外依次由dna核心、内衣壳、含脂类囊膜的内膜和外膜以及二十面体衣壳组成。最内层的病毒基因组由核心壳包围，核心壳能够保护病毒基因组免受宿主核酸酶和宿主dsdna传感器的影响，从而抑制初始感染期间的先天免疫反应，核心壳的正确组装取决于内膜和外衣壳的组装。内膜含有多种蛋白，如p17、pe183l/p54、p12、pe248r和ph108r。衣壳包含2772个壳粒，中央存在空隙与外部包膜相邻，可保护病毒免受环境中核酸酶或其他物理和化学因素的影响。外膜是asfv的最外层结构，可能参与病毒吸附和内吞作用。
3、p54蛋白是asfv的重要结构蛋白之一，由e183l基因编码，位于病毒内囊膜，参与病毒组装、诱导细胞凋亡以及中和抗体产生等过程。与asfv结构蛋白p30和p72一样，是asfv感染期间最具抗原性的蛋白之一，也是asf的一个重要的血清学检测靶点。p54蛋白属于早期膜蛋白，针对p54的抗体最早在asfv感染猪体后第八天检测到，并在感染动物的血液中持续存在数周，血清p54抗体能够强烈地抑制病毒对猪巨噬细胞的粘附作用。因此，制备p54蛋白的单克隆抗体，不仅有助于研究p54蛋白在asfv感染过程中的作用、asf致病机制和疫苗研发，而且可以建立相关的免疫学诊断方法。
4、p72是病毒颗粒的主要衣壳蛋白，根据p72基因c端的核酸序列，可将asfv分为24种基因型。该蛋白通常出现在asfv感染的晚期阶段，占病毒体总质量的31％-33％，具有序列保守性和良好的抗原性，感染后可产生高滴度的抗p72抗体，通常用于asf的血清学诊断。p54蛋白是位于asfv内囊膜的ⅰ型跨膜蛋白，分子质量在不同病毒分离株中在24-28kd之间，该蛋白被靠近n-端的疏水跨膜区(aa30-aa52)分隔形成c-末端结构域(ctd)和n-末端结构域(ntd)，分别含有131个氨基酸和60个氨基酸，其中c末端的pro-ala-ala-ala重复序列决定了可变区的可变性。通过对p54蛋白基因型的分析可进一步细化p72基因分型，如根据p54基因型可将p72基因i型的最大分支细分为4个离散子簇，分别为ιa、ιb、ιc和ιd，有助于对全球不同的asfv株进行更详细的研究。
5、asfv感染后，位于p54蛋白c端149-161位氨基酸之间的动力蛋白结合域(dbd)，与宿主微管运动复合物dynein的动力蛋白轻链8(light chain，lc8)结合并发生相互作用，在病毒内化和病毒颗粒内体运输的过程中发挥关键作用。此外，p54蛋白与lc8动力蛋白的结合位点和bcl-2促凋亡家庭的成员bim-3结合位点相似，能够使其转移至线粒体并激活caspase-9和caspase-3，经线粒体途径诱导细胞凋亡。自然感染或人为接种asfv或p54重组蛋白，均能诱导感染猪体内产生高水平的抗p54抗体，并且最早在感染8天后出现，并在血液中能够持续存在数周，是asfv血清学诊断的最佳抗原蛋白之一，与p30和p72一起被认为是检测asfv抗体的一组理想抗原靶点。
6、有研究表明，用p54重组蛋白作为抗原对39份在37℃下放置一个月的阳性血清样本进行elisa检测，其灵敏度高达95％。用截短的p54蛋白作为抗原，结合荧光微球作为示踪剂，建立的检测asf抗体的荧光免疫层析试纸条，在最佳检测条件下，仅需75μl血清即可在20分钟内检测asf抗体。说明相比于其它蛋白，p54蛋白具有更高的稳定性和亲和力，是asfv诊断的理想抗原。
7、因此，可以通过优势抗原表位的鉴定和筛选、人工合成表位多肽和多抗原表位的联合应用等提高elisa检测的灵敏度和特异性，开发稳定性、灵敏度和特异性更高以及成本更低的新型asf抗体血清学检测方法。
技术实现思路
1、本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其单克隆抗体与应用。
2、本发明的目的之一在于，提供一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽为非洲猪瘟病毒p54蛋白60～72肽段、128～148肽段或/和163～175肽段，其氨基酸序列为60aaieeediqfinp72、128matggpaaapaaasapahpae148或/和163msaienlrqrnty175。
3、本发明的目的之二在于，提供上述的抗原表位肽在检测非洲猪瘟病毒特异性抗体中的应用。
4、本发明的目的之三在于，提供非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对上述的抗原表位肽。
5、一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
6、1)以pentr4-asfv p54优化-2ha中间载体质粒为模板，pcr扩增得到非洲猪瘟病毒p54基因；
7、2)将非洲病毒p54基因与目的表达载体pet28a-6his连接获得重组原核表达质粒pet28a-p54jd-6his；
8、3)将重组原核表达质粒pet28a-p54jd-6his转化到de3/bl21感受态大肠杆菌(e.coli)，诱导表达，纯化获得截短p54蛋白(55-184aa)；
9、4)采用截短p54蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，获得三株杂交瘤细胞；
10、5)小鼠腹腔注射鼠杂交瘤细胞，采集腹水，离心收集上清，得到三株非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体。
11、本发明通过原核表达的asfv结构蛋白p54免疫小鼠制备出三株单克隆抗体，并鉴定出三个新的抗原表位“60aaieeediqfinp72”、“128matggpaaapaaasapahpae148”与“163msaienlrqrnty175”。同时将针对上述抗原表位的三株特异性单克隆抗体用于多种免疫学检测，包括但不限于elisa、wb、ifa。然后基于鉴定出的三个抗原表位和截短p54蛋白，分别探索优化出可用于检测asfv抗体的间接elisa方法和竞争elisa方法。
12、本发明的目的之四在于，提供上述非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
13、上述应用，包括elisa检测、wb检测、ifa检测。
14、为补充asf的检测诊断方法，本发明使用细胞融合杂交瘤技术制备asfv p54蛋白特异性单克隆抗体，将获得的asfv p54单克隆抗体成功用于各种免疫学试验，并鉴定p54单抗识别抗原表位。基于其抗原表位和p54单抗分别建立优化了检测asfv p54抗体的间接与竞争elisa，可用于后续商品化试剂盒的开发。
15、最后，本发明还提供了所述的抗原表位肽、单克隆抗体在诊断或检测非洲猪瘟病毒中的应用。
16、上述的应用，包括以下任一种或多种：
17、(1)所述抗原表位肽、所述单克隆抗体在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中应用；
18、(2)所述抗原表位肽、所述单克隆抗体在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒感染的药物中应用；
19、(3)所述抗原表位肽、所述单克隆抗体在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
20、本发明提供一种基于上述的抗原表位肽对非洲猪瘟病毒抗体的间接elisa检测方法。
21、该间接elisa检测方法，包括以下步骤：
22、1)将非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽60aaieeediqfinp72、128matggpaaapaaasapahpae148或/和163msaienlrqrnty175进行包被，抗原表位肽包被浓度为1.25ng/μl，每个elisa孔加入100μl，4℃条件下孵育过夜，采用5％ bsa封闭2h之后，洗涤；
23、2)加待检血清，每孔加入100μl用pbs缓冲液稀释1：10倍的非洲猪瘟阳性康复猪血清和健康猪阴性血清作为对照，孵育2h；
24、3)加酶标二抗，每孔加入100μl用pbs缓冲液稀释1：10000倍的猪源性酶标抗体，37℃孵育1h；
25、4)加显色液进行显色，加终止液终止反应；
26、5)采用酶标仪测定od450数值，p/n值≥2.0以上为阳性。
27、本发明还提供了基于上述的p54单克隆抗体及纯化的p54短截蛋白对非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa检测方法。
28、所述的竞争elisa检测方法，包括以下步骤：
29、(1)以非洲猪瘟病毒p54纯化截短蛋白(55-184aa)为包被抗原；
30、(2)以如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体为结合抗体，将稀释后的非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体与非洲猪瘟阳性猪血清和健康猪阴性血清分别混匀，加入酶标板，孵育；
31、(3)将hrp鼠源性酶标抗体以1:10000稀释后加入酶标板，37℃孵育1h；
32、(3)加显色液显色，加终止液终止反应；
33、(4)采用酶标仪测定od450数值。
34、本发明基于鉴定出的三个抗原表位和纯化的p54截短蛋白，探索优化出可用于检测asfv抗体的间接与竞争elisa方法，具有较高的特异性和灵敏度。
35、本发明针对非洲猪瘟病毒(asfv)结构蛋白p54的特异单克隆抗体是具有检测asf功能的实用性工具，可以用于多种不同的免疫学试验，包括酶联免疫吸附试验(elisa)、蛋白质印迹(wb)与免疫荧光(ifa)。本发明鉴定出p54单克隆抗体的新型抗原表位可以应用于asf抗体的检测，并建立了检测asfv抗体的间接与竞争elisa方法。
1.一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为非洲猪瘟病毒p54蛋白60～72肽段、128～148肽段或/和163～175肽段，其氨基酸序列为60aaieeediqfinp72、128matggpaaapaaasapahpae148或/和163msaienlrqrnty175。
2.非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性针对权利要求1中所述的抗原表位肽。
3.抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.如权利要求2所述非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括elisa检测、wb检测、ifa检测。
6.如权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求3所述的单克隆抗体在诊断或检测非洲猪瘟病毒中的应用。
7.基于权利要求1所述的抗原表位肽对非洲猪瘟病毒抗体的间接elisa检测方法。
8.根据权利要求7所述的间接elisa检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.基于权利要求2所述的p54单克隆抗体对非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa检测方法。
10.根据权利要求9所述的竞争elisa检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
