本发明属于干细胞冻存，尤其涉及一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法。
背景技术：
1、细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的重要作用。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用，细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。现有的干细胞冻存对细胞的保护效果较差，冻存液没有经过特殊调配，冻存的温度与冻存液没有相互匹配，导致细胞冻存的时间无法保存的更久。
技术实现思路
1、本发明的目的在于：为了解决现有的干细胞冻存对细胞的保护效果较差，冻存液没有经过特殊调配，冻存的温度与冻存液没有相互匹配，导致细胞冻存的时间无法保存的更久的问题，而提出的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
4、s1、选取一部分间充质干细胞，按照一定比例加入消化液继续消化，并观察间充质干细胞的状态，等待间充质干细胞变圆后立即加入细胞完全培养基停止消化；
5、s2、将间充质干细胞以及细胞完全培养基取出并放入离心式管内，将离心试管放入离心机中进行离心，离心后间充质干细胞沉淀在离心试管底部，上清液析出留滞在离心试管上部；
6、s3、利用无菌吸管将上清液吸出，保留离心试管底部的间充质干细胞；
7、s4、向离心试管内加入细胞悬液，然后继续颠倒混合，间充质干细胞会悬浮在细胞悬液中，方便对间充质干细胞的数量继续统计；
8、s5、将间充质干细胞以及细胞悬液分装放入至多个冻存管内，然后向冻存管内加入冻存液，封闭冻存管并分别对多个冻存管做好标记；
9、s6、利用医用棉条缠绕在冻存管外侧，然后使用医用纱布将棉条包裹在冻存管外部，随后将冻存管放入至冰箱内冷冻一段时间，最后将初步冷冻的冻存管放入至液氮中进行冷冻保存。
10、作为上述技术方案的进一步描述：
11、所述s1中，消化液的主要成分为胰酶和edta，其成分比例按照25cm2/ml胰酶/edta的标准进行配置。
12、作为上述技术方案的进一步描述：
13、所述s2中，离心机的转速为700-800min/转，离心时长为5-8min，控制离心温度处于25-35℃。
14、作为上述技术方案的进一步描述：
15、所述s3中，在吸取上清液时注意避免吸出底部的间充质干细胞。
16、作为上述技术方案的进一步描述：
17、所述s4中，细胞悬液的容量为80-100μl。
18、作为上述技术方案的进一步描述：
19、所述s4中，统计间充质干细胞的数量即为每毫升悬液中有活细胞总数，根据计数结果，将细胞总数调节至细胞数量为每毫升有4×95为宜。
20、作为上述技术方案的进一步描述：
21、所述s5中，冻存液包括二甲基亚砜(dmso)、营养添加物和冷冻保护剂，二甲基亚砜(dmso)、营养添加物和冷冻保护剂的添加比例为5：2：1。
22、作为上述技术方案的进一步描述：
23、所述二甲基亚砜(dmso)为试剂级等级，无菌且无色，可以用0.22微米滤膜过滤，冻存液添加至冻存管内后，需要快速进行摇匀，避免二甲基亚砜(dmso)出现沉淀情况。
24、作为上述技术方案的进一步描述：
25、所述s6中，棉条包裹的厚度在0.5-1cm之间。
26、作为上述技术方案的进一步描述：
27、所述s6中，冰箱的温度设置在-80℃--100℃之间，在冰箱内冷冻的时间为8-12h，在液氮中的温度为-196℃。
28、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
29、1、本发明中，通过添加营养添加物和冷冻保护剂，且控制与二甲基亚砜(dmso)的比例，且通过摇匀注入后的冻存液，能够让二甲基亚砜(dmso)、营养添加物和冷冻保护剂能够均匀混合，能够在冷冻过程中很好的保护细胞，避免细胞出现被冻坏的情况，能够避免细胞在冷冻过程中出现大面积结晶，避免细胞出现脱水的情况，不会对细胞膜造成损伤和破裂，且能够在复苏时更快的解冻。
30、2、本发明中，利用棉条能够对冻存管进行保护，避免冻存管出现损坏破裂的情况，也能够在冰冻过程中，让低温缓慢渗透至冻存管内，降低冷冻速度，避免出现速冻情况出现导致细胞内部快速结晶破裂的情况发生。
1.一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s1中，消化液的主要成分为胰酶和edta，其成分比例按照25cm2/ml胰酶/edta的标准进行配置。
3.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s2中，离心机的转速为700-800min/转，离心时长为5-8min，控制离心温度处于25-35℃。
4.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s3中，在吸取上清液时注意避免吸出底部的间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s4中，细胞悬液的容量为80-100μl。
6.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s4中，统计间充质干细胞的数量即为每毫升悬液中有活细胞总数，根据计数结果，将细胞总数调节至细胞数量为每毫升有4×95为宜。
7.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s5中，冻存液包括二甲基亚砜(dmso)、营养添加物和冷冻保护剂，二甲基亚砜(dmso)、营养添加物和冷冻保护剂的添加比例为5：2：1。
8.根据权利要求7所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述二甲基亚砜(dmso)为试剂级等级，无菌且无色，可以用0.22微米滤膜过滤，冻存液添加至冻存管内后，需要快速进行摇匀，避免二甲基亚砜(dmso)出现沉淀情况。
9.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s6中，棉条包裹的厚度在0.5-1cm之间。
10.根据权利要求1所述的一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述s6中，冰箱的温度设置在-80℃--100℃之间，在冰箱内冷冻的时间为8-12h，在液氮中的温度为-196℃。
