本发明涉及一种植物病原菌的生物防治及快速检测技术，尤其涉及一种尖孢镰刀菌番茄专化型lamp引物及检测试剂盒与应用。
背景技术：
1、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)是引起的番茄枯萎病是造成番茄死秧的主要原因，该病原菌在不同植物上有不同分型，且致病性强、传染面积广，严重影响番茄的产量和品质。
2、目前鉴定番茄枯萎病的主要方法是形态学观察和分子生物学生物技术等，这两类方法中，形态学鉴定方法耗时长，需具备专业知识，而分子生物学检测方法需要昂贵的仪器设备，且对检测产物需要测序才能判定为是何种病原菌感染。因此，建立快速有效的检测方法，及时检测出携菌植物，可减弱病害的发生和流行，从而减少植物产量的损失。
3、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称lamp)技术是一种操作简便、灵敏度高、特异性强、成本低的核酸扩增方法，该技术不需要购置昂贵精密的检测分析设备，只需要简单的加热装置，在60～65℃恒温下进行，60min内即可完成反应全过程，通过肉眼即可观察得到试验结果，lamp检测技术在植物病原菌的检测研究中得到了广泛应用。
4、另外，针对不同病原真菌lamp检测体系的构建中，多以核糖体dna内转录间隔区its区为背景进行设计引物，虽然通过对rdna-its片段进行特异性扩增便能实现对病原菌在分子水平上的分类鉴定，但对种间差异不明显的菌种则不能有效鉴定，而核糖体dna基因间隔区igs具有种间变异快、种内高度保守的特点，广泛用于同属不同种真菌的分类鉴定。
5、中国专利cn111850155a公开了一种特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用，该鉴定方法中选择igs序列设计鉴定尖孢镰刀菌的lamp引物，但是该引物仅能够鉴别区分尖孢镰刀菌与禾谷镰刀菌或腐皮镰刀菌等不同种的真菌，无法用于鉴别区分同属尖孢镰刀菌的不同专化型菌株，例如无法区分番茄专化型、黄瓜专化型和西瓜专化型。
技术实现思路
1、发明目的：本发明的目的是提供一种尖孢镰刀菌番茄专化型lamp引物，解决如何在不同专化型菌株中准确鉴别区分尖孢镰刀菌番茄专化型。本发明的另一目的在于提出一种含有上述引物的检测试剂盒，解决如何便捷利用lamp引物检测尖孢镰刀菌番茄专化型的问题，本发明的第三目的是提供一种上述试剂盒在检测鉴别尖孢镰刀菌番茄专化型中的应用，解决如何利用试剂盒鉴别尖孢镰刀菌番茄专化型。
2、技术方案：本发明所述的一种尖孢镰刀菌番茄专化型lamp引物，引物序列如下：
3、fip：5’-cggatctcttggttctggc-3’
4、bip：5’-tggaagctcgacgtgacc-3’
5、f3：5’-ggcgcaatgtgcgttcaaagattgaagaacgcagcaaaatgc-3’
6、b3：5’-tgcctgttcgagcgtcatttcatttggggaacgcgggtta-3’
7、loop b：5’-ctcagcttggtgttgggactc-3’。
8、根据lamp反应的需求，本发明进一步构建了一种含有上述引物的检测试剂盒，包含如下试剂：
9、bst dna聚合酶溶液、甜菜碱溶液、10×te缓冲液、dntps溶液、镁离子溶液、水、fip和bip引物混合液、f3和b3引物混合液和loop b引物溶液。镁离子溶液可以是硫酸镁溶液。
10、本发明以尖孢镰刀菌番茄专化型(f.oxysporum f.sp.lycopersicon，fol)的igs序列设计lamp引物，建立快速检测番茄枯萎病的lamp体系，进一步优化反应体系中dntps浓度、mg2+浓度、反应时长及反应温度，同时研究dna提取方式及不同检测模版对lamp反应效果的影响，获得效果理想的lamp检测体系。
11、优选地，所述fip和bip引物混合液、f3和b3引物混合液和loop b引物溶液中的引物浓度比为1-3：0.5-1.5：0.5-1.5。fip和bip引物混合液的浓度优选为20μmol/l，f3和b3引物混合液的浓度优选为10μmol/l，loop b引物溶液的浓度优选为10μmol/l。
12、优选地，所述bst dna聚合酶溶液的浓度为8u/μl，甜菜碱溶液的浓度为5mmol/l，dntps溶液的浓度为10mmol/l，镁离子溶液的100mmol/l。
13、优选地，bst dna聚合酶溶液、甜菜碱溶液、10×te缓冲液、dntps溶液、镁离子溶液、水、fip和bip引物混合液、f3和b3引物混合液和loop b引物溶液的体积比为0.5：1：2：1：0.5：15：2：1：1。在一些实施例中，lamp反应体系为25μl，dna模板的体积为1μl。
14、本发明应用上述检测试剂盒检测鉴别尖孢镰刀菌番茄专化型。
15、优选地，鉴别尖孢镰刀菌番茄专化型的方法包括如下步骤：
16、(1)将待测菌株的基因组dna溶液、bst dna聚合酶溶液、甜菜碱溶液、10×te缓冲液、dntps溶液、镁离子溶液、水、fip和bip引物混合液、f3和b3引物混合液和loop b引物溶液混合后50-65℃水浴反应至少30min；
17、(2)根据反应产物的荧光强度差异鉴别鉴别尖孢镰刀菌番茄专化型菌株。
18、优选地，在步骤(1)中，待测菌株的基因组dna溶液的浓度至少为1.0×10-4ng/μl。优选为1.0×10-4～1.0×10-1ng/μl。
19、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明在较低dna模板浓度下，可从不同专化型的尖孢镰刀菌中有效鉴别区分番茄专化型尖孢镰刀菌。本发明中的检测方法仅需60℃水浴条件即可完成反应过程，反应耗时短，能在1小时内获得可靠的检测结果。本发明灵敏度高，检测限可低至1.0×10-4ng/μl。
1.一种尖孢镰刀菌番茄专化型lamp引物，其特征在于，引物序列如下：
2.一种含有权利要求1所述引物的检测试剂盒，其特征在于，包含如下试剂：
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述fip和bip引物混合液、f3和b3引物混合液和loop b引物溶液中的引物浓度比为1-3：0.5-1.5：0.5-1.5。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述bst dna聚合酶溶液的浓度为8u/μl，甜菜碱溶液的浓度为5mmol/l，dntps溶液的浓度为10mmol/l，镁离子溶液的100mmol/l。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，bst dna聚合酶溶液、甜菜碱溶液、10×te缓冲液、dntps溶液、镁离子溶液、水、fip和bip引物混合液、f3和b3引物混合液和loop b引物溶液的体积比为0.5：1：2：1：0.5：15：2：1：1。
6.根据权利要求2所述检测试剂盒在检测鉴别尖孢镰刀菌番茄专化型中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，待测菌株的基因组dna溶液的浓度至少为1.0×10-4ng/μl。
