本发明涉及生物医学或生物制药，更具体地涉及一种pd-1结合分子及其应用。
背景技术：
1、程序性死亡受体-1蛋白，又称作pd-1(programmed death 1)，是一种表达在t细胞表面并起免疫抑制作用的跨膜蛋白。pd-1有两个配体分子，分别为pd-l1和pd-l2，pd-l1和pd-l2在抗原呈递细胞上有较高水平的表达。当pd-l1和pd-l2与pd-1结合后会对t细胞的功能活性起到负调控的作用，肿瘤细胞通常能够高表达pd-l1或者pd-l2来实现“免疫逃逸”(lee l等，j clin pharmacol.2016feb；56(2):157-69)。所以，pd-1药物通过对免疫系统的正向调控作用来实现对肿瘤的杀伤。现在，pd-1也是免疫检查点抑制剂疗法的代名词。
2、凭借在黑色素瘤治疗中的突出疗效，fda在2014年和2015年先后批准两个pd-1单克隆抗体pembrolizumab(keytruda)和nivolumab(opdivo)，目前适应症已经覆盖了近20种实体瘤(prasad v等，semin oncol.2017apr；44(2):132-135.)。目前国内已有4款pd-1单抗药物上市，分别是恒瑞的卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、百济神州的替雷利珠单抗(tislelizumab)、信达的信迪利单抗(sintilimab)和君实的特瑞普利单抗(toripalimab)。
3、研究发现，传统的scfv抗体在t细胞中表达量低，难以充分发挥pd-1抑制剂的效果，这主要是由于scfv抗体本身易聚集、折叠易错配、热稳定性低等性质导致的(martin n等，macromol biosci.2017feb；17(2))。而纳米抗体则具有易表达、稳定性高、亲和力高等天然优势，根据纳米抗体自身优势和pd-1生物学机制，开发pd-1纳米抗体具有非常广阔的应用前景。开发一种新型抗pd-1单域抗体，使其具有较好的特异性、阻断活性、临床药效，并且生产简便、成本低、减轻用药负担，已经成为亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种新型抗pd-1结合分子及其应用。
2、本发明第一方面提供一种pd-1结合分子，包含抗pd-1单域抗体，所述单域抗体的互补决定区cdr包含cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1包括seq id no:1所示的序列、cdr2包括seq id no:2所示的序列、和cdr3包括seq id no:3所示的序列。
3、其序列如下表任一行所示：
4、
5、
6、在一个或多个实施方案中，所述单域抗体vhh的fr1可选自表1中各抗体编号的vhh的fr1，vhh的fr2可选自表1中各抗体编号的vhh的fr2，vhh的fr3可选自表1中各抗体编号的vhh的fr3，vhh的fr4可选自表1中各抗体编号的vhh的fr4。
7、在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的fr区为选自seq id no:184-319的任一vhh的fr区。
8、在一个或多个实施方案中，所述单域抗体vhh如seq id no:184-319中任一所示。优选地，所述单域抗体如seq id no:197、200、223-230、232-260、262-309中任一所示。
9、在一个或多个实施方案中，所述pd-1结合分子是包含一条、两条或多条本文所述的抗pd-1单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
10、在一个或多个实施方案中，所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自g和s的1-15个氨基酸组成。
11、在一个或多个实施方案中，所述重链抗体的抗原结合片段是单链重链抗体。
12、在一个或多个实施方案中，所述重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。
13、在一个或多个实施方案中，所述重链抗体还包含重链恒定区。
14、在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含ch2和ch3。在一个或多个实施方案中，所述ch2和ch3是人igg fc的ch2和ch3，例如igg4的ch2和ch3。优选地，所述重链恒定区如seq id no:321所示。
15、在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是软骨鱼重链抗体的恒定区，包含ch1、ch2、ch3、ch4和ch5。
16、在一个或多个实施方案中，所述抗体是包含所述抗pd-1单域抗体作为重链可变结构域的抗体。
17、在一个或多个实施方案中，所述抗体还包含轻链可变结构域、重链恒定域和轻链恒定域。
18、在一个或多个实施方案中，抗体的抗原结合片段选自fab、f(ab’)2、fv、scfv。
19、在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
20、本发明还提供多核苷酸，选自：
21、(1)本文任一实施方案所述单域抗体或本文所述抗体或其抗原结合片段的编码序列；
22、(2)(1)的互补序列；
23、(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。
24、在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。
25、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸的序列如seq id no:322或323所示。
26、本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的多核苷酸。
27、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
28、本发明还提供含本文任一实施方案所述pd-1结合分子的噬菌体。
29、在一个或多个实施方案中，所述pd-1结合分子展示于所述所述噬菌体表面。
30、本发明还提供一种宿主细胞，选自：
31、(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述pd-1结合分子；
32、(2)包含本文所述的多核苷酸；和/或
33、(3)包含本文所述的核酸构建物。
34、本发明还提供一种产生pd-1结合分子的方法，包括：在适合产生pd-1结合分子(例如单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述pd-1结合分子。
35、本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述pd-1结合分子、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。
36、在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。
37、在一个或多个实施方案中，所述癌症是pd-1相关癌症。优选地，所述癌症选自：黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等。
38、本发明还提供本文任一实施方案所述pd-1结合分子在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
39、在一个或多个实施方案中，所述癌症是pd-1相关癌症。优选地，所述癌症选自：黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等。
40、本发明还提供一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的pd-1结合分子，或含有本发明任一实施方案所述的pd-1结合分子的药物组合物。
41、在一个或多个实施方案中，所述癌症是pd-1相关癌症。优选地，所述癌症选自：黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等。
42、本发明还提供一种检测pd-1的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述pd-1结合分子、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞。
43、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测pd-1与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
44、在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与pd-1结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述pd-1结合分子或分离地存在于试剂盒中。
45、本发明还提供一种检测样品中pd-1存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述pd-1结合分子与样品孵育，和检测pd-1与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合，从而确定样品中pd-1存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
46、本发明还提供本文任一实施方案所述pd-1结合分子在制备用于检测样品中pd-1、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
1.一种pd-1结合分子，包含抗pd-1单域抗体，所述单域抗体的互补决定区cdr包含cdr1、cdr2和cdr3，其序列如下表任一行所示：
2.如权利要求1所述的pd-1结合分子，其特征在于，所述单域抗体vhh如seq id no:197、200、223-230、232-260、262-309中任一所示。
3.如权利要求1或2所述的pd-1结合分子，其特征在于，所述pd-1结合分子是包含一条或多条所述单域抗体的单价或多价单域抗体或重链抗体；优选地，所述pd-1结合分子是重链抗体，所述重链抗体还包含重链恒定区；更优选地，所述重链恒定区如seq id no:321所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自：
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含权利要求4所述的多核苷酸，优选地，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：
7.一种产生pd-1结合分子的方法，包括：在适合产生pd-1结合分子的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞。
8.一种检测pd-1的试剂盒，所述的试剂盒包含权利要求1-3中任一项所述的pd-1结合分子，优选地，所述试剂盒还包括用于检测pd-1与pd-1结合分子的结合的试剂，优选地，所述试剂是通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
9.一种检测样品中pd-1存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以权利要求1-3中任一项所述的pd-1结合分子与样品孵育，和检测pd-1与pd-1结合分子的结合，从而确定样品中pd-1存在情况。
10.权利要求1-3中任一项所述的pd-1结合分子在制备用于检测样品中pd-1的试剂盒中的用途。
