本发明涉及生物医药，尤其涉及一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法。
背景技术：
1、2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，t2dm)，旧称非胰岛素依赖型糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus，niddm)或成人发病型糖尿病(adult-onsetdiabetes)，患者特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等。目前，临床上使用的治疗2型糖尿病的药物主要有双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、dpp-4受体抑制剂、sglt-2受体抑制剂和glp-1衍生物等。而其中，glp-1衍生物由于具有与胰岛素类似的降糖效果，同时几乎无低血糖风险、兼具减重效果和心血管保护功能，正逐渐成为2型糖尿病的主要治疗药物和研究热点。
2、目前，glp-1衍生物因其具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用正逐渐成为2型糖尿病的主要治疗药物和研究热点。同时，glp-1还具有抑制胃酸分泌、延迟胃排空、抑制食欲等作用，具有部分减重效果。gcg是在胰脏的α细胞中生成的激素，在机体寒冷、饥饿等应激状态下作用于肝脏，将肝脏中的糖原进行分解而提高血糖。此外，gcg在体内还具有促进脂肪降解、脂肪氧化、发热等作用(diabetologia,2017,60,1851-1861)，长期给药可以通过增加能量代谢量而呈现出体重减轻药效。具备glp-1受体和gcg受体激活活性的双靶点共激动剂，尤其是利用了gcg体内具有促进脂肪降解、脂肪氧化等功能，使其相比glp-1单靶点激动剂，不仅可以更有效降血糖，而且具有显著增强的减重功效。
3、目前，glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物可以通过化学合成方法制备，也可以通过构建重组工程菌发酵表达后再进行纯化修饰的生物发酵方法制备。cn115536739a提供了一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽的制备方法，其将fmoc-linker-mbha树脂或王氏树脂置于多肽合成仪的反应柱内进行溶胀去保护反应；并按照肽链从c端到n端的序列，依次加入相应的带有保护基团的氨基酸，重复偶联反应和脱保护反应的步骤，直至肽链合成完毕，其中，用于连接侧链的氨基酸k在反应中使用的带有保护基团的形式为fmoc-lys(dde)-oh，肽链合成完毕后，脱除第24位的氨基酸k的dde保护基，然后进行侧链修饰；肽树脂进行裂解、纯化，得到所述多肽衍生物，产品纯度大于95％。cn114349828a同样介绍了一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽的化学合成方法，其经过树脂的溶胀，fmoc保护基的脱除，肽链的延长，lys侧链的修饰，多肽的裂解，多肽的纯化等7步获得目标多肽衍生物。专利申请cn114591415也同样提出了一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽的肽链的制备方法，通过在编码多肽基因的5'端添加sumo标签的基因序列，从而形成融合基因，将该融合基因克隆至原核表达载体，并在大肠杆菌细胞中进行诱导表达，离心收集菌体后，超声破碎并离心取上清，然后通过镍柱纯化获得融合蛋白，最后sumo蛋白酶酶切处理后，经反相纯化获得目标多肽。
4、上述通过化学合成法制备glp-1受体和gcp受体共激动剂多肽的记载，同样采用的是常规固相法，逐个氨基酸偶联。由于目标多肽序列长、结构复杂，合成过程中难以避免肽树脂缩聚造成的偶联困难以及相应杂质的产生，同时由于相关路线均先完成主链的合成再进行侧链的修饰，导致所使用的fmoc-lys(dde)-oh氨基酸的侧链dde基团在后续氨基酸脱保护试剂20％pip/dmf反复处理下，发生部分脱除，从而产生错结肽杂质，产品纯度难以满足药品安全性要求。多肽的盐型和盐含量对于产品溶解性，稳定性以及生物活性至关重要，上述专利均未报道glp-1/gcp受体共激动剂多肽的换盐方法，以及如何控制产品中盐离子的含量。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法。
2、本发明中术语“glp-1”是指对人天然glp-1氨基酸进行修饰获得的多肽，所述修饰包括去除和/或取代(置换)和/或添加(延长)一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是人工合成的氨基酸。
3、本发明中，术语“受体共激动多肽衍生物”可被定义为与受体结合并引发天然配体典型的响应的化合物。完全激动剂可被定义为引发与天然配体相同量级的响应的激动剂(参见，例如，“principles of biochemistry”,al lehninger,dl nelson,mmcox,第二版,worth publishers,1993,第763页)。因此，例如，“glp-1受体激动剂”可被定义为能够与glp-1受体结合并能够将其活化的化合物。
4、本发明中，术语“gcg受体激动剂”可被定义为能够与gcg受体结合并能够将其活化的化合物。
5、本发明中，“glp-1受体和gcg受体共激动多肽”能表现出相对于天然胰高血糖素针对胰高血糖素受体活性的至少约10％至约500％或更大，并亦表现出相对于天然glp-1针对glp-1受体活性的约至少10％至约200％或更大。
6、本发明中，术语“肽”包含3个或更多个氨基酸且通常小于50个氨基酸的序列，其中氨基酸为天然存在的或非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸指不在人体内天然存在的氨基酸，但其同样可被引入到本文所述的肽结构中。
7、本发明中，有关肽(例如glp-1或gcg)的术语“衍生物”表示经化学修饰(如共价修饰等)的肽或其类似物。典型的修饰包括酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。
8、本发明中，术语“保护氨基酸”是指氨基酸的功能基团与其它基团反应而封闭了氨基酸功能基团活性的氨基酸衍生物。其中α-位芴甲氧羰基(fmoc)-保护，末端-叔丁氧羰基(boc)-保护是最重要的形式。
9、本发明提供了一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法，所述衍生物通过glp-1受体和gcg受体共激动多肽的第24位的氨基酸k残基上的ε氨基与hooc(ch2)16co-γ-glu-(aeea)2-连接，所述多肽的氨基酸序列为：
10、h-aib-hgtftsdyssyldaraahefvkwlleggpssg(seq id no.1)；
11、本发明的多肽衍生物通过其多肽的第24位的氨基酸k残基上的ε氨基与脂肪酸侧链酰化连接；即所述多肽的k24的ε氨基与上述脂肪酸侧链连接。其中，“k数字”表示的是共激动多肽序列“数字”所表示位置的赖氨酸(k)，其ε-氨基与侧链进行连接；如“k24”表示为相应共激动多肽序列第24位的赖氨酸，并表示通过该赖氨酸的ε-氨基与相应脂肪酸侧链连接。
12、在本发明中，所述共激动多肽序列中尾端的“-nh2”表示在所述尾端，将尾端氨基酸羧基中的羟基替换为“-nh2”，即将尾端氨基酸的cooh修饰为conh2。具体结构如下所示：
13、
14、按照iupac命名法，hooc(ch2)16co-γ-glu-(aeea)2-可以被称为“[2-(2-[2-(2-[2-(2-)4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(s)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]”。
15、本发明中共激动多肽衍生物的制备方法包括如下步骤：
16、(1)将fmoc-gly(linker)-otbu与固相树脂结合，得到fmoc-gly(linker-树脂)-otbu；
17、(2)在步骤(1)基础上，按照seq id no.1所示的氨基酸序列，使用固相合成法合成至第25位氨基酸w，即合成至w-l-l-e-g-g-p-s-s-g；
18、(3)使用r1-lys(r2)-oh连接第24位的lys，r1、r2分别独立地选自fmoc、alloc、dde，并按照侧链序列逐步完成侧链的连接；
19、(4)脱去r1保护剂，并按照seq id no.1所示氨基酸序列完成肽链的合成；
20、(5)对步骤(4)制备的产物进行裂解反应，得到所述glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物粗品；
21、(6)步骤(5)制备的glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物粗品经溶解、反相hplc纯化、沉淀、转盐和冻干后得到纯品。
22、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(1)中linker结构为：
23、
24、作为本发明的一种优选技术方案，步骤(1)中所述固相树脂为wang树脂或am树脂；当使用wang树脂时，树脂的取代度范围为0.4-0.6mmol，例如0.45mmol、0.50mmol、0.55mmol等；当使用am树脂时，am树脂的取代度范围为0.4-0.9mmol，例如0.5mmol、0.6mmol、0.7mmol、0.8mmol等。
25、更优选地，步骤(1)中所述固相树脂为取代度范围为0.4-0.9mmol的am树脂，将所述am树脂在diea/dmf溶液中进行溶胀0.5-2h后，去除溶剂；称取适量fmoc-gly(linker)-otbu、hobt，溶解于dmf中，并加入dic活化后，在25-35℃开始反应；反应45-80min后加入dipea，继续反应120-180min后，去除反应液，并用dmf洗涤得到fmoc-gly(linker-树脂)-otbu。
26、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(2)中具体为按照seq id no.1所示的氨基酸序列，使用fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh·h2o、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh，偶联合成至第25位氨基酸w，即合成肽段w-l-l-e-g-g-p-s-s-g。
27、作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)和步骤(4)所述固相合成均使用缩合试剂，缩合试剂选自hobt/dic，hobt/dic/碱，oxyma/dic，pyaop/碱，pybop/碱，hbtu/碱，hatu/碱的混合物。
28、作为本发明的一种优选技术方案，在所述步骤(3)中，当r1或r2为fmoc时，保护基的脱除选用20％的pip/dmf；当r1或r2为alloc时，保护基的脱除选用5-10当量(例如6、7、8、9等)苯硅烷与0.1-0.3当量(例如0.2等)的四三苯基膦钯，以dcm为溶剂；当r1或r2为dde时，保护基的脱除选用含2％水合肼的dmf，或者含有1mol/l盐酸羟胺+1mol/l dipea的dmf混合溶液。
29、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(3)中，使用的r1-lys(r2)-oh为dde-lys(fmoc)-oh，并使用fmoc-aeea-oh、fmoc-glu-otbu、octadecanedioic acid(otbu)偶联完成侧链的连接。
30、更为优选地，所述步骤(2)和步骤(3)具体为：称取适量步骤(1)中制备得到的fmoc-gly(linker-树脂)-otbu置于反应器中，并向反应器中加入pip/dmf溶液，控温20-35℃开始反应，反应20-40min，去除溶液，再用dmf洗涤并抽干，称取适量fmoc-ser(tbu)-oh、hobt加入dmf中溶解，并加入dic后加入到反应器中，补加一定量的dmf，控温20-35℃开始反应；反应60-120min后抽掉反应液，树脂用dmf洗涤并抽干；并按照肽序列继续依次偶联fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh·h2o、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、dde-lys(fmoc)-oh；继续向反应器中加入pip/dmf溶液，控温25±5℃开始反应，反应20-40min后，去除溶液，并用dmf洗涤后抽干，按照侧链序列继续依次偶联fmoc-aeea-oh、fmoc-aeea-oh、fmoc-glu-otbu、octadecanedioicacid(otbu)；得到中间偶联产物。
31、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(4)中，使用fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh·h2o、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-aib-oh，按照seq id no.1所示氨基酸序列完成肽链的合成。
32、更优选地，所述步骤(4)具体为：以dmf为溶剂，配制盐酸羟胺和dipea混合溶液，并加入步骤(3)的反应器中，搅拌并控温20-30℃开始反应，反应40-80min后抽去溶液；重复上述反应步骤1次后，使用dmf、dipea/dmf先后多次洗涤抽干；称取fmoc-val-oh、hobt溶解于dmf中，并加入dic活化后加入到反应器中，补加一定量的dmf，搅拌、控温25-30℃开始反应，反应60-120min后抽掉反应液，用dmf洗涤抽干，然后按照肽序列继续依次偶联fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh·h2o、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-his(trt)-oh、boc-his(trt)-aib-oh，偶联反应结束后，抽干溶剂，收缩树脂，产物进行真空干燥。
33、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(5)的裂解反应中使用的裂解液为三氟乙酸、茴香硫醚、苯甲醚、三异丙基硅烷、苯酚、1,2-乙二硫醇和水中任意一种或多种的组合。
34、更优选地，所述步骤(5)具体为：配制裂解液(tfa:edt:tis:phoh:h2o＝90:2.5:2.5:2.5:2.5)；将适量步骤(4)中产物加入配制好的预先降温至6-15℃的切割液中，搅拌情况下，将切割体系缓慢恢复至25-30℃后，反应2-4h；抽滤切割液后用tfa洗涤，并合并滤液。滤液缓缓的加入到甲基叔丁基醚中沉降；沉降结束后，去除上清液，将下层固体打浆、洗涤、离心，去除上清液，得粗肽湿肽，干燥后得到所述粗肽。
35、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤(6)中所述提纯包括反相hplc纯化、沉淀和转盐。
36、优选地，本发明使用柠檬酸体系和乙酸铵体系进行两次反相hplc纯化，优选地，将粗肽使用柠檬酸水溶液溶解，过滤后加入乙腈和醋酸，使溶液中水：乙腈：醋酸比例调节到6:3:1，然后进行两次反相hplc纯化；更优选地，将每10g粗肽使用400-800ml的25-35mm的柠檬酸水溶液溶解；优选地，具体两次反相hplc纯化条件为：
37、(1)柠檬酸体系纯化中，a相为浓度20-50mmol/l的柠檬酸水溶液，b相为乙腈，色谱柱为c18反相色谱柱，梯度洗脱条件包括：以流动相a和流动相b混合液为洗脱剂，首先20％b相冲洗5-15min，而后在60min内b相由28％升至45％，最后80％b相冲洗8-15min，色谱图出峰时开始收集产物。
38、(2)乙酸铵体系纯化中，a相为3-6g/l、ph为6.0-7.5的乙酸铵溶液，b相为乙腈，色谱柱为c18反相色谱柱，梯度洗脱条件包括：以流动相a和流动相b混合液为洗脱剂，首先15％b相冲洗5-15min，而后在60min内b相由26％升至55％，最后80％b相冲洗8-15min，色谱图出峰时开始收集产物。
39、优选地，所述沉淀的条件为将反向hplc纯化收集产物使用无机酸调节ph至4.5-5.5，优选ph为4.8-5.2，沉淀出固体后过滤、洗涤。
40、优选地，所述转盐为使用无机碱搅拌溶解沉淀的固体，并调节溶液ph至7.0-7.8，优选地，所述无机碱选自氢氧化钠或氨水。
41、本发明公开的制备方法能够使得成品纯度高达99.5％以上，具有显著提高的制备效果。
42、作为本发明的一种优选技术方案，所述制备方法还包括步骤(6)：将得到的含有多肽衍生物的溶液利用酸性溶液进行纯化ii、洗涤、复溶、过滤、冻干，得到所述多肽衍生物。
43、同时，在制备方法中引入换盐方法，可以根据需要控制产品中盐的含量，使得最终成品的纯度高达99.5％以上且最大单杂小于0.15％，对多肽的工业化生产具有重大意义。
44、本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
45、(1)本发明采用侧链特殊linker保护的gly氨基酸与树脂连接，由于该linker具有一定的空间位阻，有利于改善肽树脂在后续氨基酸连接过程发生缩聚现象，降低偶联难度。
46、(2)本发明在适当的位置采用了二肽，避免了相应的缺失肽和消旋肽的产生。
47、(3)本发明采用先侧链后主链的策略，避免了因近20次反复碱处理引起dde保护基团脱除而导致的错结肽产生，同时先完成侧链的连接，有利于树脂体积膨胀，改善肽树脂缩聚带来的影响。通过上述改进的手段，产品的粗品纯度可以提升到75％以上，粗品收率80％以上。
48、(4)本发明首次采用的30mm柠檬酸/乙腈体系纯化glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物，对杂质有明显的清除效果，可以通过一次纯化有效地将粗品纯度提升到97％，配合乙酸铵体系进一步精制，可以得到纯度大于99.5％的产品。
49、(5)本发明通过酸调节ph沉淀出目标多肽衍生物，再使用碱溶液溶解来完成换盐工艺。此方法可通过溶解ph的变化来控制产品盐含量，以满足产品溶解性和稳定性的要求，而制备柱换盐则不能达到控制产品盐含量的目的；
50、(6)本发明通过酸调节ph沉淀出目标多肽衍生物，再使用碱溶液溶解来完成换盐工艺，与制备柱换盐相比，无需旋蒸操作，减少了冻干前溶液的体积，提高了设备生产效率，可用于规模化、工业化生产。
1.一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述衍生物通过glp-1受体和gcg受体共激动多肽的第24位的氨基酸k残基上的ε氨基与脂肪酸侧链hooc(ch2)16co-γ-glu-(aeea)2-连接，所述多肽的氨基酸序列见seq id no.1；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中linker结构为：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述固相树脂为wang树脂或am树脂；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述裂解反应中使用的裂解试剂为三氟乙酸、茴香硫醚、苯甲醚、三异丙基硅烷、苯酚、1,2-乙二硫醇或水中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤(5)中所述粗品溶解于柠檬酸、乙酸和水的混合溶液中，得到衍生物粗品溶液；
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，使用柠檬酸体系和乙酸铵体系进行两次反相hplc纯化，纯化条件为：
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，按照seqid no.1所示的氨基酸序列，使用fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh·h2o、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh，偶联合成至第25位氨基酸w。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，使用的r1-lys(r2)-oh为dde-lys(fmoc)-oh，并使用fmoc-aeea-oh、fmoc-glu-otbu、octadecanedioicacid(otbu)偶联完成侧链的连接。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，使用fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh·h2o、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-ala-oh·h2o、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-aib-oh，按照seqid no.1所示氨基酸序列完成肽链的合成。
