本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒的制备方法与应用。
背景技术：
1、脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的颅内恶性肿瘤，其在脑内肿瘤边缘往往不清晰，很少能通过手术实现肿瘤的完全切除。同时，脑胶质瘤具有两个突出的组织病理学特征，即血脑屏障(blood-brain-barrier，bbb)和血瘤屏障(blood-brain tumor barrier，btb)。一方面bbb阻止了98％以上的小分子及100％的大分子药物渗透入脑，但同时bbb的物质转运机制可以保证脑内营养物质的需求，如跨细胞膜通道转运和细胞旁路通道转运。这种生理条件下的物质交换机制，为脑肿瘤靶向药物递送系统的设计提供了必要的理论依据。此外，随着脑胶质瘤的病情进展，新生血管不断生成，原有的脑毛细血管也被整合到肿瘤内部，由此形成了btb。虽然这部分血管壁上具有一定的孔径，但其保留了bbb的部分功能，因此，对脑肿瘤靶向纳米药物递送系统的设计提出了挑战。
2、近年来，蛋白质和肽等生物分子的自组装引起了人们对功能材料的超分子构建的极大兴趣。然而，蛋白质和肽通常具有免疫原性并且其结构复杂，因此使用氨基酸可作为更简单的构建块。在天然蛋白质中，约三分之一的蛋白质含有金属离子。这些金属离子既作为参与蛋白质的酶、电子和光子功能的辅助因子，又作为主要通过金属配位(即金属离子和金属结合配体之间的共价相互作用)保留和调节蛋白质结构的结构组分。与蛋白质自组装中涉及的常见非共价相互作用(如疏水效应、范德华力、氢键、离子吸引和π效应)相比，金属配位由于近乎共价的特性而是一种强相互作用。金属离子与蛋白质或者特定氨基酸(如组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸)之间存在很强的协调性。例如，使用l-半胱氨酸(以其氧化二聚体l-胱氨酸的形式)和锌离子作为构建块，在zncl2存在下，l-胱氨酸和锌离子发生自组装，在水溶液中可形成具有均匀尺寸的球形颗粒。有趣的是，通过改变氨基酸和金属离子的浓度，可以很容易地将颗粒的大小控制为纳米级或微米级。众所周知，fmoc被广泛用作肽合成中的主要胺保护基团，其固有的疏水性和芳香性可促进芴环的疏水性和π-π堆积相互作用。因此，许多fmoc修饰的氨基酸和短肽具有相对快速的自组装动力学，在细胞培养、模板、光学器件、药物递送、催化、治疗和抗生素等多个领域具有显著的理化性质和巨大的应用潜力。
3、化学动力学疗法(chemodynamic therapy，cdt)是一种通过活性氧(ros)介导的杀伤癌细胞的创新肿瘤治疗策略，即利用芬顿或芬顿样反应(fe2++h2o2→fe3++·oh+oh-)通过转换内源性h2o2在肿瘤细胞中过表达成有毒的·oh。过量产生的·oh是一种ros，具有很强的氧化活性，通过磷脂过氧化、线粒体功能障碍和dna损伤等方式引起严重的氧化损伤，诱导肿瘤凋亡。
4、光热疗法(photothermal therapy，ptt)是指材料吸收电磁能，并将电磁能转化为热能，从而诱导癌细胞凋亡或坏死的治疗方法。作为一种非侵入性的肿瘤治疗途径，ptt已受到重视。它是一种局部加热的治疗手段，不仅可以避免手术治疗后经常出现的感染问题，还可以减少化疗用药的副作用。通常，近红外光被应用于ptt，而具有高近红外光热转换能力的材料被称为光热剂(photo-thermal agent，pta)。这些材料被特定波长的光照射时，它们从光子中吸收能量，从基态转变为激发态，动能增加，从而能够对周围微环境进行加热。多巴胺是一种神经传导物质，能够用来帮助细胞传送脉冲。它作为反应单体，在碱性条件下(ph＞7.5)，以氧气为氧化剂，即可发生自聚合形成聚多巴胺(pda)。近年来，pda以其良好的生物相容性、独特的化学结构和产生光热效应的能力，作为一种高效的光热剂正迅速融入生物医学领域肿瘤靶向给药系统的构建。同时，研究表明，ptt带来的高温不仅可以杀灭肿瘤细胞，还可以提高芬顿反应的速率并产生更多的·oh，因此ptt和cdt的联合治疗在抗肿瘤中具有巨大的潜力。
5、唾液酸(sa)是拥有9个碳原子主链的单糖。据文献报道，sa可作为配体与脑微血管内皮细胞中sa的特异性受体sa粘附素结合，通过受体介导的内吞作用提高bbb的通透性。kuo等人制备 了负载姜黄素的壳聚糖-聚乳酸-羟基乙酸纳米制剂，sa修饰以提高bbb的通透性，修饰抗醛脱氢酶靶向脑癌干细胞用于治疗多形性胶质母细胞瘤，结果显示，sa的修饰提高了该纳米复合物体外bbb模型的穿透。
6、胶质瘤的快速生长需要消耗大量的营养物质。因此，bbb和胶质瘤细胞过表达多种营养转运蛋白，这些转运蛋白被积极探索为实现脑药物特异性高效传递的潜在途径。其中乳铁蛋白(lf，mw～80kda)属于转铁蛋白(tf)家族，能够与bbb中的lf受体(lfr)特异性结合。组织学研究表明，lfr表达于脑微血管内皮细胞，同时，lfr在胶质瘤细胞上也大量表达。因此，lf修饰的载体可以通过lfr介导的内吞作用穿过bbb并靶向胶质瘤。
7、化学疗法作为癌症治疗最有效的方法之一仍然应用于治疗前线，例如表柔比星(epirubicin，epi)。epi是一种蒽环类药物，为nih临床收藏446种fda批准的药物库中最有效的抗胶质母细胞瘤药物之一。作为阿霉素的主体异构体，其具有与多柔比星相似的作用机制和类似的抗肿瘤活性，但是比更高的生物相容性治疗指数。
技术实现思路
1、基于上述现有技术，本发明提供了一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒是基于金属-氨基酸配位相互作用，通过fmoc-l-色氨酸与铜离子的配位作用形成的配位物作为稳定的纳米粒内核，外面包裹光热材料pda，并进一步修饰sa修饰的白蛋白和lf，可增加纳米粒的稳定性并赋予纳米粒靶向脑胶质瘤的能力，最后药物epi通过静电吸附负载在纳米粒表面得到脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒(lsp@f-cu/epi nps)。静脉注射给药后，在lf和sa的靶向分子作用下，lsp@f-cu/epinps能顺利透过血脑屏障，并靶向于脑胶质瘤；同时，在808nm红外光照射下，pda可以发挥光热效果，有利于载体透过血脑屏障，并升高肿瘤温度促使肿瘤凋亡；此外，cu2+与肿瘤细胞内h2o2发生芬顿反应产生·oh可发挥抗癌效果，并且与化疗药物epi协同发挥作用，诱导细胞凋亡；所述一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒粒径为130nm；在1.5w/cm2，808nm近红外激光照射10min，浓度为200μg/ml的脑胶质瘤靶向系统水溶液从室温25℃升高到约65℃。
2、本发明成功制备了一种脑胶质瘤靶向的生物金属-有机纳米多功能颗粒的脑胶质瘤靶向系统，制得的纳米粒分散均匀、粒径均一；
3、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
4、一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，特点是该脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒包括生物金属-有机纳米粒、靶向分子、光热材料以及药物。
5、一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，其特征在于，所述生物金属-有机纳米粒以fmoc-l-色氨酸为骨架，铜离子进行配位形成的配位物；所述靶向分子为唾液酸(sa)和乳铁蛋白(lf)；所述光热材料为聚多巴胺(pda)；所述药物为盐酸表柔比星(epi)。
6、进一步地，本发明所述的一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒的制备方法，包括以下具体步骤：
7、(1)称取80mg sa溶于2ml的dmso-h2o(1∶1)溶液中，加入10倍当量的edc和nhs，冰浴活化4h，缓慢滴加三乙胺调ph值，呈弱碱性即可，往里加入20mg的牛血清白蛋白(bsa)，放入40℃水浴中搅拌48h。将反应溶液装入透析袋中(mwco＝3500da)，纯水透析48h，每12h换一次水，去除未反应的小分子物质，透析完成后，置于冷冻干燥机干燥12h得到sa修饰的bs(sa-bsa)；
8、(2)将10mg fmoc-l-色氨酸溶于300μl naoh溶液(0.1m ph 13)中，纯水稀释至10mg/ml，磁力搅拌下以1∶2摩尔比加入cu2+溶液，室温下密闭反应24h，将反应后的溶液装入透析袋中(mwco＝8000-12000)，纯水透析12h，去除未反应的fmoc-l-色氨酸和杂质，置于冷冻干燥机干燥12h，得到生物金属-有机纳米粒(f-cu nps)；
9、(3)将10mg盐酸多巴胺溶于纯水中，快速加入10ml ph 9的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，敞口搅拌15min，随即加入2ml f-cu nps(5mg/ml)，敞口搅拌12h，离心(12000rpm，10min)得到沉淀，洗涤3次，即得pda包裹的f-cu nps(p@f-cu nps)；
10、(4)将p@f-cunps，sa-bsa溶液(5mg/ml)和lf溶液(4mg/ml)(2∶1∶1，v/v/v)共混后，室温避光搅拌24h，12000rpm离心10min，即得脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒(lsp@f-cu nps)；
11、(5)将600μl epi溶液(1mg/ml)缓慢滴加到2ml lsp@f-cu nps中，室温避光搅拌24h，12000rpm离心10min，洗涤，收集即得载药的lsp@f-cu nps(lsp@f-cu/epi nps)。
12、本发明提供了一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒在制备光热疗法、化学动力疗法以及化学疗法协同治疗脑胶质瘤产品中的应用。
13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
14、(1)本发明提供一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒的制备方法，通过fmoc-l-色氨酸与铜离子的配位作用形成的配位物作为稳定的纳米粒内核，同时，金属离子cu2+还可以发挥化学动力学疗法，外面包裹光热材料pda，可以发挥光热疗法，同时协助实现血脑屏障透脑效应，纳米粒表面进一步修饰sa修饰的白蛋白和lf，可增加纳米粒的稳定性并赋予纳米粒透过血脑屏障靶向脑胶质瘤的能力，最后药物epi通过静电吸附负载在纳米粒表面发挥化学疗法；
15、(2)本发明纳米粒所用原料均无毒、成本低且具有高度的生物相容性，例如色氨酸是人体必需氨基酸，多巴胺主要存在于中枢神经系统中，在人体中起着重要的调节作用，而乳铁蛋白是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，唾液酸主要是从颌下腺黏蛋白中分离出来的一种物质，铜离子为人体必需金属元素，且cu+类的芬顿反应比fe2+快约160倍，并且在ph 6.5-6.9范围生成·oh能力最强；
16、本发明所述制备方法不需要昂贵的仪器设备，能够简便且绿色环保地制备一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，通过光热疗法、化学动力疗法以及化学疗法协同治疗脑胶质瘤，效果相较于其他使用单一方法治疗脑胶质瘤的药物递送系统更加显著，对于脑胶质瘤靶向治疗药物传递系统的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义，可以作为今后研究肿瘤靶向药物系统的一个方向。
1.一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，其特征在于，所述脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒包括生物金属-有机纳米粒、靶向分子、光热材料以及药物。
2.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，其特征在于，所述生物金属-有机纳米粒以fmoc-l-色氨酸为骨架，铜离子进行配位形成的配位物；所述靶向分子为唾液酸(sa)和乳铁蛋白(lf)；所述光热材料为聚多巴胺(pda)；所述药物为盐酸表柔比星(epi)。
3.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒是基于金属-氨基酸配位相互作用，通过fmoc-l-色氨酸与铜离子的配位作用形成的配位物作为稳定的纳米粒内核，外面包裹光热材料pda，并进一步修饰sa修饰的白蛋白和lf，可增加纳米粒的稳定性并赋予纳米粒靶向脑胶质瘤的能力，最后药物epi通过静电吸附负载在纳米粒表面得到脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒(lsp@f-cu/epi nps)。静脉注射给药后，在lf和sa的靶向分子作用下，lsp@f-cu/epi nps能顺利透过血脑屏障，并靶向于脑胶质瘤；同时，在808nm红外光照射下，pda可以发挥光热效果，有利于载体透过血脑屏障，并升高肿瘤温度促使肿瘤凋亡；此外，cu2+与肿瘤细胞内h2o2发生芬顿反应产生·oh可发挥抗癌效果，并且与化疗药物epi协同发挥作用，诱导细胞凋亡；所述一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒粒径为130nm；在1.5w/cm2，808nm近红外激光照射10min，浓度为200μg/ml的脑胶质瘤靶向系统水溶液从室温25℃升高到约65℃。
4.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下具体步骤：
5.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤靶向的多功能生物金属-有机纳米粒在制备光热疗法、化学动力疗法以及化学疗法协同治疗脑胶质瘤产品中的应用。
