本发明涉及疫苗研制，具体涉及一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的载体及其制备方法和用途。
背景技术：
1、脊髓灰质炎病毒属于微小rna病毒科肠道病毒属。该病毒在电镜下呈直径20～30nm的球形颗粒，立体对称20面体。病毒颗粒中心为单股正链核糖核酸，外围60个衣壳蛋白，形成外层衣壳，此种病毒核衣壳体裸露无囊膜。核衣壳含4种结构蛋白vp1、vp3和由vp0分裂而成的vp2和vp4。vp1为主要的外露蛋白至少含2个表位(epitope)，可诱导中和抗体的产生，vp1对人体细胞膜上受体(可能位于染色体19上)有特殊亲和力，与病毒的致病性和毒性有关。vp0最终分裂为vp2与vp4，为内在蛋白与rna密切结合，vp2与vp3半暴露，具抗原性。
2、脊髓灰质炎病毒根据血清型被分为ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型。其中ⅰ型脊髓灰质炎在3种类型中最具神经侵袭性，多数脊髓灰质炎流行及地方性流行病例都是由ⅰ型脊髓灰质炎引起的，其次分别为ⅲ型和ⅱ型，且三种血清型之间并无交叉免疫保护作用。
3、目前，脊髓灰质炎的治疗没有特效药，主要采取的是接种疫苗为主的预防措施。目前国内外普遍使用的用来预防脊髓灰质炎的疫苗有灭活疫苗(inactivated poliovirusvaccine，ipv)和口服减毒疫苗(oral poliovirus vaccine，opv)。opv在1958年研制成功在美国上市，后来推广至全球。opv的优点包括接种简单(口服)、费用低、可产生稳定的肠道粘膜免疫、有效阻断脊灰病毒传播等。但随着全世界消灭脊灰目标的推进，生物安全在遏制脊灰病毒传播中的作用越来越重要。服用opv后产生的疫苗相关麻痹型脊灰(vaccineassociated paralytic poliomyelitis，vapp)病例以及因回复突变产生的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(vaccine-derived poliovirus，vdpv)越来越受到关注，包括可引起脊髓灰质炎流行的循环疫苗衍生脊灰病毒(circulating vaccine-derived polioviruses，cvdpvs)和免疫缺陷疫苗衍生脊灰病毒(immunodeficient related vaccine-derivedpoliovirus，ivdpv)。ipv是由3种类型脊髓灰质炎病毒组成的混合物经过细胞培养、收获上清、纯化以及甲醛灭活等而制备的疫苗。ipv的免疫原性和安全性都很理想，能有效预防脊灰爆发。并且ipv不存在引起vapp、cvdpvs等风险，其群体免疫优于opv。ipv疫苗相较opv免疫安全性好，但是接种ipv不能形成明显的肠道局部免疫，且成本显著高于opv。
4、随着现代生物科学技术的发展，基于病毒样颗粒(virus-like particles,vlp)的基因工程技术疫苗备受关注。vlp是由病毒的一个或多个结构蛋白在表达系统内重组表达,并自行组装形成不含病毒遗传物质且不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。具有和天然病毒颗粒类似的空间立体结构,可通过和病毒感染一样的途径提呈给免疫细胞,有效地诱导机体产生免疫保护反应。
5、形成脊髓灰质炎病毒vlp需要vp0、vp1、vp3三个蛋白的参与，因此，需要构建多顺反子。例如可以构建含有多个启动子的表达载体。通过把vp0、vp1、vp3基因连接至不同启动子的下游，利用启动子来控制相关基因的表达。例如构建“p1-启动子2-启动子1-3cd”，该技术路线模拟天然vlp形成的过程，vp0有肉豆蔻酰化，vlp结构相对稳定；但是因为vp0修饰过程，产量较低，且3cd基因对宿主细胞具有毒性，影响产量，同时可能影响产量的稳定性。再例如构建“构建vp1-启动子2-启动子1-vp2-启动子3-vp0”，该种方式由于无3cd基因，对细胞毒性较小，产量高；无3cd基因毒性，毒种稳定性较好，但是因为vp0修饰过程，产量受到影响；且由于引入了3个启动子，载体的负担较大，转染以及表达效率低，蛋白的表达蛋白表达较为不均衡。
6、目前还可利用剪切多肽连接目的基因序列进行多顺反子的构建，例如，连接序列2a、ires、lp4序列、nia蛋白酶等。其中由于2a(具有d-x-e-x-n-p-g-p氨基酸序列)剪切效率更高同时能够平衡上下游基因的表达，因此较为常用。例如，现有技术构建“vp1-启动子2-启动子1-vp2-2a-vp0”，该方式解决了上下游基因表达不平衡的问题，不需要蛋白酶参与该过程并且剪切效率高。同时由于无肉豆蔻酰修饰，产量显著提升，也无3cd基因毒性，稳定性较好；但是2a残留在某个亚基的末端，vp0无肉豆蔻酰化，vlp的3d结构稳定性较差。
技术实现思路
1、本发明的提供一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的载体及其制备方法和应用，具体地，
2、本发明第一方面，提供一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒(vlps)载体，所述脊髓灰质炎病毒选自i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒和/或iii型脊髓灰质炎病毒，所述的病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白；所述载体携带编码vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白的基因，其中，vp0、vp1或vp3中任意两个基因通过intein-自剪切序列连接。
3、具体地，所述inte in(下称int)的氨基酸序列如seq id no:4所示；
4、具体地，所述自剪切序列为2a、nia蛋白酶或lp4识别序列；优选的，所述2a序列为编码含d-x-e-x-n-p-g-p氨基酸的2a多肽的核酸序列。
5、优选地，所述inte in-2a氨基酸序列如如seq id no:5-7所示。
6、具体地，自剪切2a多肽为东亚细亚病毒2a序列(thoseaasigna virus 2a,t2a)、e2a序列、f2a序列、fmdv 2a序列(foot-and-mouth disease virus 2a，f2a)、猪捷申病毒2a(porcine teschovirus-12a，p2a)序列。
7、具体地，所述基因vp0、vp1或vp3中两个基因间存在启动子，包括启动子ⅰ和启动子ⅱ，并且启动子ⅰ和启动子ⅱ为反方向表达；优选的，启动子包括pph或p10启动子。
8、优选的，所述连接的两个基因包括，vp1和vp0组合，vp0和vp3组合，或者vp1和vp3组合。在一个具体的实施方式中，所述连接的两个基因包括vp0和vp3组合。
9、具体地，vp0、vp1或vp3中一个基因在启动子ⅰ的下游位置，其余两个基因在启动子ⅱ下游位置；优选的，所述的vp0、vp3基因在ppolh启动子下游；所述的vp1基因在p10启动子下游。
10、优选的，所述载体为穿梭质粒，所述穿梭质粒选自psfv、peuk-c1、ptet-splice、ppur、pmamneo、pmam、pbi121、pbi101、pdr2、pcmvebna、psvk3、yacneo、pmsg、psvl、pch110、pkk232-8、p3'ss、psg5、pxt1、pmbac、ppbac、pmclneo、pyes2、pog44、pac360、pbluebachis、pvl1392、pbluebaciii、pcdna1、pcdm8、pcdna3、pzeosv、prep4、pebvhis、pcep4 pfastbac、pfastbac ht、pfastbac dual或其衍生物或变体，优选的，所述穿梭质粒为pfastbac或pbacpak8-dual。
11、优选的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白来源于i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒或iii型脊髓灰质炎病毒的结构蛋白或其突变体。
12、更优选的，所述vp0、vp1、vp3结构蛋白来源于i型、ii型和/或iii型脊髓灰质炎病毒(分别简称为i型，ii型，iii型)的蛋白的突变体。进一步优选的，所述突变体相对于野生型蛋白具有以下突变：
13、1)t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g，
14、2)q3178l、t1041i和y1159f，或者
15、3)l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v。
16、在一个具体的实施方式中，所述三种结构蛋白相对于野生型具有如上的突变。
17、更优选的，所述vp1蛋白，
18、1)相对于野生型i型sabin1的结构蛋白具有t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g的突变；
19、2)相对于野生型ii型mef-1的结构蛋白具有q3178l、t1041 i和y1159的突变；或者，
20、3)相对于野生型ii i型sabin3的结构蛋白具有l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v的突变。
21、本发明第二方面，提供一种上述任一种载体在制备脊髓灰质炎病毒样颗粒中的应用。
22、优选的，所述脊髓灰质炎病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更优选的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白来源于i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白或其突变体。
23、更优选的，上述结构蛋白来源于i型、ii型和/或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白的突变体。进一步优选的，所述突变体相对于野生型蛋白具有以下突变：
24、1)t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g，
25、2)q3178l、t1041i和y1159f，或者，
26、3)l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v。
27、在一个具体的实施方式中，所述结构蛋白相对于野生型具有如上的突变。
28、更优选的，所述结构蛋白：
29、1)i型：sabin1的结构蛋白具有t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g的突变；
30、2)ii型：mef-1的结构蛋白具有q3178l、t1041i和y1159的突变；
31、3)iii型：sabin3的结构蛋白具有l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v的突变。
32、本发明第三方面，提供一种脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，所述制备方法包括利用上述任一种载体表达脊髓灰质炎病毒样颗粒。
33、优选的，将合成的vp1基因插入到载体中；将vp0和vp3基因通过intein-自剪切序列进行连接，插入载体，获得插入了外源基因的载体；更优选的，所述vp1基因在启动子1的下游，所述vp0和vp3基因在启动子2下游，进一步优选的，所述载体为质粒，更为优选的，所述质粒为表达i型、ii型或ii i型脊髓灰质炎病毒样颗粒的穿梭质粒。
34、具体地，将所述载体转染宿主细胞，表达脊髓灰质炎病毒样颗粒，优选的，所述的宿主细胞为hek293、酵母细胞或spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞sf9；更优选的，所述的宿主细胞为spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞sf9。
35、具体地，所述穿梭质粒选自psfv、peuk-c1、ptet-splice、ppur、pmamneo、pmam、pbi121、pbi101、pdr2、pcmvebna、psvk3、yacneo、pmsg、psvl、pch110、pkk232-8、p3'ss、psg5、pxt1、pmbac、ppbac、pmclneo、pyes2、pog44、pac360、pbluebachis、pvl1392、pbluebaciii、pcdna1、pcdm8、pcdna3、pzeosv、prep4、pebvhis、pcep4 pfastbac、pfastbacht、pfastbac dual或衍生物或变体，优选的，所诉穿梭质粒为pfastbac或pbacpak8-dual。
36、具体地，将所述表达不同血清型脊髓灰质炎病毒样颗粒的穿梭质粒，分别通过flashbac系统共转染细胞，获得第一代可表达不同血清型脊髓灰质炎病毒样颗粒的杆状病毒。
37、具体地，所述表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的穿梭质粒分别通过flashbac系统共转染sf9昆虫细胞，分别获得第一代可表达i、ii或iii型脊髓灰质炎病毒样颗粒的杆状病毒。
38、具体地，用所述sf9昆虫细胞对第一代杆状病毒进行连续扩增，获得第三代病毒；优选的，将获得的第三代杆状病毒感染悬浮细胞，培养1～10天，待细胞全部裂解后离心收获上清，将收获的上清膜包超滤浓缩，蔗糖梯度超速离心，得到脊髓灰质炎病毒样颗粒。
39、本发明第四方面，提供一种上述制备方法制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒。
40、优选的，所述脊髓灰质炎病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更优选的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白来源于i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白或其突变体。
41、更优选的，所述三种结构蛋白来源于i型、ii型和/或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白的突变体。
42、进一步优选的，所述突变体相对于野生型蛋白具有以下突变：
43、1)t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g，
44、2)q3178l、t1041i和y1159f，或者，
45、3)l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v。
46、在一个具体的实施方式中，所述结构蛋白相对于野生型具有如上的突变。
47、更优选的，所述结构蛋白：
48、1)i型：sabin1的结构蛋白具有t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g的突变；
49、2)ii型：mef-1的结构蛋白具有q3178l、t1041i和y1159的突变；
50、3)iii型：sabin3的结构蛋白具有l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v的突变。
51、本发明第五方面，提供一种上述脊髓灰质炎病毒样颗粒在制备抗脊髓灰质炎i型、ii型和/或iii型病毒预防性药物中的应用；优选的，所述药物为疫苗。
52、本发明第六方面，提供一种药物，所述药物包括上述的脊髓灰质炎病毒样颗粒，优选的，所述药物为疫苗。
53、具体地，所述疫苗还包括药学上可接受的辅料；优选的，所述疫苗为注射剂或吸入制剂，更优选的，为肌肉注射剂、皮下注射剂或雾化吸入剂，更为优选的，所述疫苗为肌肉注射剂、皮下注射剂或雾化吸入剂。
54、有益的技术效果
55、本发明通过构建“vp1-启动子2-启动子1-vp3-int2a-vp0”三基因共表达载体的方法，获得可表达由三种蛋白组成的复合物或者病毒样颗粒的表达载体，该表达载体产量显著提升，载体遗传稳定性较好，且无linker序列残留，获得的脊髓灰质炎病毒样颗粒接近天然构象。利用该技术路线制备的脊髓灰质炎ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型病毒样颗粒可用于制备基于病毒样颗粒的脊髓灰质炎疫苗，该疫苗针对脊髓灰质炎病毒感染能激发更高水平的中和抗体。
1.一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒(vlps)的载体，其特征在于，所述脊髓灰质炎病毒选自i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒和/或iii型脊髓灰质炎病毒，所述病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白；所述载体携带编码vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白的基因，其中，vp0、vp1和vp3基因中的任意两个基因通过intein-自剪切序列连接。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述自剪切序列为2a、nia蛋白酶或lp4识别序列；优选的，所述2a序列为编码含d-x-e-x-n-p-g-p氨基酸的2a多肽的核酸序列；更优选的，所述intein的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的载体，其特征在于，所述2a多肽为东亚细亚病毒2a(t2a)序列、e2a序列、f2a序列、fmdv 2a序列、马鼻炎a病毒(erav)2a、小核糖核酸病毒2a序列、c型轮状病毒2a样序列、猪捷申病毒2a(2a)序列或昆虫病毒2a样序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的载体，其特征在于，任选的，所述基因vp0、vp1或vp3中两个基因间存在启动子，包括启动子ⅰ和启动子ⅱ，并且启动子ⅰ和启动子ⅱ为反方向表达；优选的，启动子包括pph或p10启动子；优选的，所述脊髓灰质炎病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更优选的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白来源于i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒和/或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白或其突变体，
5.根据权利要求1-4任一项所述的载体，其特征在于，vp0、vp1或vp3中一个基因在启动子ⅰ的下游位置，其余两个基因在启动子ⅱ下游位置；优选的，所述的vp0、vp3基因在ppolh启动子下游；所述的vp1基因在p10启动子下游，更优选的，所述载体为穿梭质粒，所述穿梭质粒选自psfv、peuk-c1、ptet-splice、ppur、pmamneo、pmam、pbi121、pbi101、pdr2、pcmvebna、psvk3、yacneo、pmsg、psvl、pch110、pkk232-8、p3'ss、psg5、pxt1、pmbac、ppbac、pmclneo、pyes2、pog44、pac360、pbluebachis、pvl1392、pbluebaciii、pcdna1、pcdm8、pcdna3、pzeosv、prep4、pebvhis、pcep4 pfastbac、pfastbac ht、pfastbac dual或其衍生物或变体，进一步优选的，所述穿梭质粒为pfastbac或pbacpak8-dual。
6.权利要求1-5任一项所述的载体在制备脊髓灰质炎病毒样颗粒中的应用，优选的，所述脊髓灰质炎病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更优选的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白来源于i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒和/或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白或其突变体，进一步优选的，所述突变体相对于野生型蛋白具有以下突变：
7.一种利用权利要求1-5任一项所述载体表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将合成的vp1基因插入到载体中；将vp0和vp3基因通过intein-自剪切序列进行连接，插入载体，获得插入了外源基因的载体；更优选的，所述vp1基因在启动子1的下游，所述vp0和vp3基因在启动子2下游，进一步优选的，所述载体为质粒，更为优选的，所述质粒为表达i型、ii型和/或iii型脊髓灰质炎病毒样颗粒的穿梭质粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述载体转染宿主细胞，表达脊髓灰质炎病毒样颗粒，优选的，所述的宿主细胞为hek293、酵母细胞或spodopterafrugiperda草地夜蛾细胞sf9；更优选的，所述的宿主细胞为spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞sf9。
9.根据权利要求7-8任一项所述的制备方法，其特征在于，将表达不同血清型脊髓灰质炎病毒样颗粒的穿梭质粒，分别通过flashbac系统共转染细胞，获得第一代可表达不同血清型脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组杆状病毒。
10.根据权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述穿梭质粒选自psfv、peuk-c1、ptet-splice、ppur、pmamneo、pmam、pbi121、pbi101、pdr2、pcmvebna、psvk3、yacneo、pmsg、psvl、pch110、pkk232-8、p3'ss、psg5、pxt1、pmbac、ppbac、pmclneo、pyes2、pog44、pac360、pbluebachis、pvl1392、pbluebaciii、pcdna1、pcdm8、pcdna3、pzeosv、prep4、pebvhis、pcep4 pfastbac、pfastbacht、pfastbac dual或其衍生物或变体，优选的，所述穿梭质粒为pfastbac或pbacpak8-dual。
11.根据权利要求7-10任一项所述的制备方法，其特征在于，所述表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的穿梭载体分别通过flashbac系统共转染sf9昆虫细胞，分别获得第一代可表达i、ii或iii型脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组杆状病毒。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，用所述sf9昆虫细胞对第一代重组杆状病毒进行连续扩增，获得第三代病毒；优选的，将获得的第三代杆状病毒感染悬浮细胞，培养1～10天，待细胞全部裂解后离心收获上清，将收获的上清用膜包超滤浓缩，蔗糖梯度超速离心，得到脊髓灰质炎病毒样颗粒。
13.一种权利要求7-12任一项所述的制备方法制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒，优选的，所述脊髓灰质炎病毒样颗粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更优选的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白来源于i型脊髓灰质炎病毒、ii型脊髓灰质炎病毒和/或iii型脊髓灰质炎病毒的蛋白或其突变体，进一步优选的，所述突变体相对于野生型蛋白具有以下突变：
14.一种权利要求13所述的脊髓灰质炎病毒样颗粒在制备抗脊髓灰质炎i型、ii型和/或iii型病毒预防性药物中的应用；优选的，所述药物为疫苗。
15.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求13所述的脊髓灰质炎病毒样颗粒，优选的，所述药物为疫苗，更优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料；进一步优选的，所述疫苗为注射剂或吸入制剂，更为优选的，所述疫苗为肌肉注射剂、皮下注射剂或雾化吸入剂。
