本发明属于生物医药，特别是涉及一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架及制备方法与应用。
背景技术：
1、癌症是威胁人类健康的最致命的疾病之一。蛋白治疗被认为是通过恢复功能失调的内源性蛋白或诱导癌细胞凋亡来调控细胞功能的最直接的策略，在癌症治疗中具有很大的潜力。然而，蛋白药物进入机体后易降解、血浆清除速度快、细胞膜渗透性差和脱靶效应对治疗蛋白有效递送到肿瘤部位构成了重大挑战。因此，迫切需要一种简便、通用的载体，有效的介导治疗蛋白在体内的递送，并实现治疗蛋白在肿瘤部位的可控释放，在提高疗效的同时降低对正常组织的毒副作用。
2、依靠金属配位键和共价键形成的金属有机框架(mofs)和共价有机框架(cofs)等多孔晶体材料具有高孔隙率、结构多样性和可调性等优势，已被广泛开发作为蛋白递送的潜在平台。然而，mofs和cofs的制备过程中需要引入金属离子或有机溶剂，会给实际应用带来潜在毒性问题。氢键有机框架(hofs)是由有机配体通过相对较弱的分子间氢键相互作用组装而成的一类多孔晶体材料，hofs除了具有mofs和cofs两类多孔晶体材料的优势以外，其制备条件更加温和，且无金属掺杂，具有良好的生物安全性和较低的毒性。
3、目前，hofs在生物医用领域的应用主要集中在酶/蛋白质保护方面。例如，通过原位封装策略基于四(4-羧基苯基)甲烷和四(4-脒基苯基)甲烷构建的hof/酶复合材料，可以在各种苛刻环境中保持天然酶的催化活性。然而，由于hofs的晶体性质，在生理环境中易沉淀，尚不能满足体内蛋白递送需求；此外，现有hofs缺乏智能响应性，不能实现治疗蛋白在肿瘤部位的有效释放。因此，有必要对其进行结构改造、表面修饰等方法来提供其性能。
4、在恶性肿瘤组织中，肿瘤细胞快速增殖消耗氧气，而血管异常又抑制了氧气供应，这使得肿瘤组织处于乏氧状态。基于肿瘤这一特性，在构筑hof的配体分子单元中引入乏氧敏感的偶氮键，用于制备乏氧响应性hof，其可在肿瘤乏氧微环境的刺激下解体，从而实现治疗蛋白的可控释放，发挥高效的抗肿瘤作用。聚乙二醇修饰是一种常用的药物递送体系修饰技术，不仅可以增加体系的稳定性，还可以增加其在体内血液循环中的滞留时间，从而提高药物到达肿瘤部位的效率。将聚乙二醇分子连接在配体分子单元的边臂上，不会影响分子间氢键的形成，而能使所构筑的hof修饰上聚乙二醇，提高hof的稳定性及体内相容性。
5、目前，尚未有聚乙二醇修饰的乏氧响应性载蛋白hofs的报道。
技术实现思路
1、根据现有技术的不同，本发明提出如下技术方案：
2、本发明的第一个目的是提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。基于该技术目的，本发明通过在配体分子边臂上修饰聚乙二醇分子增加氢键有机框架的生理稳定性，并利用偶氮键作为乏氧响应元件，实现氢键有机框架对乏氧环境的响应和可控蛋白释放效果。
3、本发明的第二个目的是提供一种构成乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的配体分子聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸。
4、本发明的第三个目的是提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法。
5、本发明的第四个目的是提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。
6、本发明的技术方案概述如下：
7、一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
8、1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸和聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸溶于蒸馏水中，加入碱溶液去质子化，得到二羧酸配体溶液；所述二羧酸配体溶液中偶氮苯-4，4’-二羧酸和聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸的摩尔比为30:(1～3)；
9、2)将四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白溶于蒸馏水中得四脒基配体溶液，所述二羧酸配体溶液中总二羧酸配体的摩尔浓度为四脒基配体溶液中四(4-脒基苯基)甲烷的摩尔浓度的2倍；
10、3)在1500～1800rpm搅拌条件下，将等体积的二羧酸配体溶液与四脒基配体溶液混合，
11、搅拌10～60min，离心，蒸馏水洗涤，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。
12、所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或四丁基氢氧化铵。
13、所述四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白的质量比为10:(1～3)。
14、所述蛋白为细胞色素c或rna酶或具体的药物。
15、本发明的聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸，其特征是用下述方法制成：
16、1)将4-氨基水杨酸甲酯和碳酸钾加入反应容器中，在搅拌下，溶于有机溶剂中，加入3-溴丙炔，在氮气保护下反应，得到化合物(i)：4-氨基-2-(丙-2-炔基氧基)苯甲酸甲酯；
17、所述4-氨基水杨酸甲酯、碳酸钾和3-溴丙炔的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)；
18、所述有机溶剂为n，n-二甲基甲酰胺(dmf)、丙酮或乙腈；
19、2)将化合物(i)、nai加入反应容器中，用四氢呋喃(thf)溶解，在氮气保护下加入次氯酸叔丁酯(t-buocl)，反应，得到化合物(ii)：4,4'-(二氮烯-1,2-二基)(e)-双(2-(丙-2-炔基氧基)苯甲酸二甲酯；
20、所述化合物(i)、nai和次氯酸叔丁酯的摩尔比为1:(2～3):(2～3)；
21、3)将化合物(ii)、叠氮-聚乙二醇加入反应容器中，用thf溶解，再加入cuso4·5h2o水溶液和抗坏血酸钠水溶液，在氮气保护下，反应，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和naoh用水溶解，搅拌，纯化，干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(iii)：
22、(e)-4,4'-(二氮烯-1,2-二基)双(2-(1-(聚乙二醇2000)-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯甲酸；
23、所述化合物(ii)、叠氮-聚乙二醇、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠的摩尔比为1:(2～3):(1.2～1.5):(1.2～1.5)；
24、所述叠氮-聚乙二醇中聚乙二醇的重均分子量为2000～5000；
25、反应式为：
26、
27、其中x＝45～114。
28、本发明提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。在上述乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备过程中，将具有促凋亡作用的蛋白细胞色素c负载于氢键有机框架中，获得一种乏氧响应性载细胞色素c氢键有机框架，其作为抗肿瘤药物，在体外可以显著降低肿瘤细胞存活，在体内可以抑制肿瘤生长。
29、本发明的优点：
30、本发明制备工艺简单，条件温和，易于操作，所用原料生物安全性高，具有良好的生物相容性。本发明通过引入聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸制备乏氧响应性载蛋白氢键有机框架，其呈棒状结构，长径约为200nm，具有良好的生理稳定性，能够在模拟乏氧环境还原剂存在的条件下降解，促进所负载蛋白的释放。本发明制备的乏氧响应性载细胞色素c氢键有机框架可以有效携载细胞色素c进入细胞，对4t1细胞产生明显的杀伤作用，在体内显著抑制肿瘤生长。
1.一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架；其特征是，在配体分子边臂上修饰聚乙二醇分子增加氢键有机框架的生理稳定性，并利用偶氮键作为乏氧响应元件，实现氢键有机框架对乏氧环境的响应和可控蛋白释放效果。
2.权利要求1所述一种构成乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，其特征是，包括如下步骤:
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或四丁基氢氧化铵。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白的质量比为10:
5.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述蛋白为细胞色素c或rna酶或具体的药物。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是，聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸制备方法包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述有机溶剂为n，n-二甲基甲酰胺(dmf)、丙酮或乙腈。
8.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述化合物(ii)、叠氮-聚乙二醇、cuso4·5h2o和抗坏血酸钠的摩尔比为1:(2～3):(1.2～1.5):(1.2～1.5)。
9.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述叠氮-聚乙二醇中聚乙二醇的重均分子量为2000～5000。
10.权利要求1的一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。
